近年来，线粒体自噬因其在调节细胞能量代谢、维持细胞稳态以及参与多种疾病的发生发展中的关键作用而成为国家自然科学基金支持的研究热点，得到了众多关注。
线粒体研究与自噬相结合，可谓是“强强联合”，让研究高度更上一层楼。
线粒体自噬（Mitophagy）是一种特殊的自噬过程，涉及多种蛋白和信号通路的相互作用。
▲细胞内的多种自噬过程
DOI: 10.1080/15548627.2020.1725377
▲线粒体自噬研究时间线
DOI: 10.1038/s41392-023-01503
今天我们从定义、分子机制、检测方法、在疾病中的研究、文献解读等角度，深入了解线粒体自噬相关内容。
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线粒体自噬的定义
在活性氧(ROS)胁迫、营养缺乏、细胞衰老等外界刺激的作用下，会导致线粒体DNA(mtDNA)突变逐渐累积，还会使细胞内线粒体膜电位降低和去极化损伤。
为了维持线粒体和细胞稳态，防止受损线粒体损伤细胞，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成溶酶体的降解，这个过程称为线粒体自噬(mitophagy)。
简言之，线粒体自噬是一种通过特异性清除细胞质中功能失调的线粒体，从而维持线粒体功能的完整性和细胞稳态的选择性自噬。
▲线粒体自噬的主要过程
DOI: 10.7150/thno.79876
根据线粒体自噬过程的特征, 可分为4个关键步骤：
前期：受损线粒体去极化，失去膜电位；
a.线粒体损伤识别：受损线粒体发生去极化，被自噬小体识别。
b.信号通路激活：PINK1/Parkin通路是最经典的线粒体自噬信号通路。当线粒体膜电位（MMP）受损时，PINK1在线粒体外膜积累，招募并激活Parkin。Parkin作为E3泛素连接酶，泛素化线粒体上的蛋白质。
早期：自噬体包裹受损线粒体，形成线粒体自噬体；
a.自噬体形成：泛素化的线粒体蛋白被自噬受体如p62、OPTN、NDP52等识别，这些受体通过与LC3结合，启动自噬体的形成。
b.线粒体包裹：自噬体膜扩展并包裹受损线粒体，形成线粒体自噬体。
中期：线粒体自噬体与溶酶体融合；
融合后形成成熟的线粒体自噬溶酶体。
后期：线粒体内容物被溶酶体降解
溶酶体或液泡酸性水解酶流入自噬体降解受损线粒体，营养物质得以循环再利用。
线粒体自噬的分子机制
线粒体自噬的机制通常可以分为2类: 泛素依赖途径和非泛素依赖途径。当然还其他非经典机制，后面会讲到。
▲线粒体自噬的 Ub 依赖途径 (PINK1/Parkin 通路最为常见) 和 Ub 非依赖性途径。
在 Ub 依赖性通路中，PINK1/Parkin 通路是最常见的。此外，一系列可以直接与 LC3 结合而不会引起广泛泛素化的线粒体自噬受体参与 Ub 非依赖性通路。DOI: 10.7150/thno.79876
线粒体自噬的两种途径在通路和关键靶点上存在明显差别。
泛素依赖途径主要依赖于PINK1和Parkin的相互作用，通过泛素化线粒体外膜蛋白来启动自噬；而非泛素依赖途径则是由线粒体自噬受体如NIX、BNIP3和FUNDC1等直接与自噬相关蛋白结合来启动自噬。这两种途径在维持细胞内线粒体质量和功能方面起着重要作用，异常线粒体自噬与多种疾病的发生和发展密切相关。
1）泛素依赖途径
（Ubiquitin-dependent pathways）
泛素依赖途径的关键蛋白是PINK1（PTEN诱导的假定激酶1）和Parkin。
这一途径也被称为PINK1–Parkin介导的线粒体自噬途径（PINK1–Parkin mediated mitophagy）。
PINK1的作用：
PINK1是一种位于去极化线粒体上的丝氨酸/苏氨酸激酶。在稳态条件下，胞质中的PINK1前体蛋白在线粒体靶向定位序列的引导下进入线粒体，随后被位于线粒体基质和内膜上的蛋白酶切割，再被释放到胞质中被泛素-蛋白酶体水解。
线粒体膜电位降低时，PINK1进入线粒体内膜的路径受阻，被滞留在线粒体外膜上，积累的PINK1前体会形成二聚体发生自磷酸化而被激活。
Parkin的作用：
Parkin是一种E3泛素连接酶，可催化泛素转移到线粒体底物。
活化的PINK1能从胞质招募Parkin到线粒体外膜上并激活其E3酶活性。
Parkin使线粒体外膜蛋白泛素化，泛素链又被PINK1磷酸化，磷酸化泛素修饰的外膜蛋白则作为“eat me”信号被自噬衔接蛋白（如p62、NDP52和OPTN等）识别，启动自噬。
其他机制：
也有研究报道PINK1能越过Parkin，直接通过泛素磷酸化将自噬衔接蛋白OPTN和NDP52募集到线粒体，进而促进自噬的生物发生（Non-Parkin dependent pathway）。
2）非泛素依赖途径
（Ub-independent pathways）
非泛素依赖的线粒体自噬是由线粒体自噬受体（Mitophagy Receptors）来主导，这些受体如NIX、BNIP3和FUNDC1等都包含一个保守的LC3结合域（LIR），它们可以通过LIR基序直接与自噬相关蛋白（如LC3）结合，启动自噬。
NIX/BNIP3L：
NIX也被称为BNIP3L，最初被报道参与红细胞成熟过程中的线粒体清除。
NIX蛋白可以通过BH3结构域直接与LC3结合，诱导线粒体自噬。
BNIP3：
BNIP3也位于线粒体外膜中，并且包含可以与LC3结合的BH3结构域。
敲除BNIP3后，缺氧条件下小鼠神经元细胞的线粒体自噬水平明显降低。
FUNDC1：
FUNDC1是一种线粒体外膜蛋白，通过与LC3相互作用，可诱导哺乳动物细胞在缺氧条件下发生帕金森非依赖性线粒体自噬。
尽管FUNDC1介导的线粒体自噬不依赖于Parkin，但另一种线粒体E3泛素连接酶MARCH5可以通过FUNDC1的泛素降解来调节缺氧条件下的线粒体自噬。
3）其他非经典机制
清除和回收线粒体
根据近期研究，除了已知的PINK1依赖和独立的途径外，还存在其他非经典机制来清除和回收线粒体。
▲线粒体自噬途径的示意图。这里我们主要关注c、d、e三张图。DOI：10.1038/s42255-023-00930-8
一种由溶酶体驱动的线粒体衍生囊泡(MDV)降解途径已被确认，这种途径会在遭遇氧化应激时快速反应，消除受损但未去极化的线粒体。尽管MDV产生的确切机制尚待进一步探索，但已知其生物发生需要PINK1和Parkin的启动，同时，氧化心磷脂可能对线粒体膜突出有促进作用(上图c)。
此外，细胞内的线粒体还可能通过外排作用被挤出细胞，形成含有线粒体的细胞外囊泡，即外球。这些外球由细胞质膜起泡形成，可将线粒体传递至其他细胞。一旦被远端细胞吸收，外球中的线粒体内容物会被释放，并通过典型的线粒体自噬过程进行降解。这一机制有助于受损线粒体从心肌细胞或棕色脂肪组织转移和降解至巨噬细胞，以及从视网膜神经节细胞轴突线粒体转移至星形胶质细胞(上图d)。在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中，也观察到了类似的机制，当神经元细胞的蛋白稳态受损时，通过此种机制可清除受损的线粒体(上图d)。
在缺氧条件下，研究发现细胞器(特别是巨线粒体)的扩大和功能失调可以促进线粒体与溶酶体的接触，随后溶酶体被线粒体吞噬并进行线粒体自消化(上图e)。
线粒体自噬检测
常用检测方法
荧光显微镜和流式细胞仪：通过使用特定的荧光探针（如JC-1）来测定线粒体膜电位，从而评估线粒体自噬的发生。
免疫印迹：检测线粒体蛋白（如PINK1、Parkin、FUNDC1）的表达和修饰状态，以及线粒体自噬标志物（如LC3-II）的水平。
电子显微镜：直接观察线粒体自噬体的形成和溶酶体融合的情况。
基因敲除或敲降技术：通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）敲除或敲降线粒体自噬相关基因，研究其在细胞中的功能。
线粒体自噬各期检测方法的
适用阶段
▲ EM 电子显微镜技术(Electron microscopy)， FM 荧光显微镜技术(Fluorescence microscopy)， IF 免疫荧光技术(Immunofluorescence)，IB 免疫印迹技术(Immunoblotting)，FC 流式细胞技术(Flow cytometry)，TMRM 四甲基罗丹明甲酯(Tetramethyl rhodamine methyl ester)， MTG 线粒体示踪绿(MitoTracker green)，LTR 溶酶体示踪红(LysoTracker red)。
线粒体自噬在疾病中的研究
线粒体自噬作为细胞应对内外环境变化的一种保护机制，在调节细胞能量代谢、维持细胞稳态以及参与多种疾病的发生发展中扮演着重要角色。
▲线粒体自噬的调节可能成为治疗某些疾病的新方向；DOI:10.7150/thno.79876
神经退行性疾病
帕金森病（PD）：帕金森病与线粒体自噬密切相关。特定基因（如PINK1和PARKIN）的突变会影响线粒体自噬的过程，导致线粒体功能紊乱和神经细胞的死亡。
线粒体自噬的缺陷可能引发PD的发展，而增强线粒体自噬功能可能有助于延缓疾病进程。
阿尔茨海默病（AD）：阿尔茨海默病中，线粒体自噬的减弱可能在疾病发展过程中起到加速作用。
与健康人群相比，AD患者的线粒体自噬调节因子（如ATG5、Parkin、ULK1和TBK1）的蛋白水平明显降低。此外，AD患者海马中的PINK1水平也有所降低，这些变化均表明线粒体自噬与AD的发病机制存在关联。
其他：如亨廷顿病（HD）等神经退行性疾病也与线粒体自噬有关。HD与突变亨延顿蛋白（mHtt）有关，mHtt的聚集抑制自噬，增加磷酸化Htt的水平。增强自噬的总水平或有效增加自噬的识别可成为HD的治疗新靶点。
心血管疾病
心肌缺血/再灌注损伤：在心肌缺血/再灌注损伤中，线粒体自噬的作用尤为重要。促进损伤线粒体的及时清除可以减轻心肌损伤，提供潜在的治疗策略。
此外，线粒体自噬还参与心脏功能的维护，确保心脏在高能量需求下稳定运行。
骨骼肌疾病
肌肉衰老与线粒体自噬：随着年龄的增长，骨骼肌中的线粒体自噬功能会出现失调。这种失调会导致功能失调的线粒体无法被有效清除，进而造成线粒体的积累，影响肌肉力量和行走表现。
▲与线粒体自噬改变相关的疾病状况；DOI：10.1038/s42255-023-00930-8
增强线粒体自噬功能可能有助于缓解肌肉衰老的影响。
杜氏肌营养不良症
杜氏肌营养不良症患者的肌肉中存在线粒体自噬缺陷，这进一步证实了线粒体自噬在骨骼肌疾病中的重要作用。
代谢性疾病
2型糖尿病（T2D）和肝病：在2型糖尿病和肝病的临床前模型中，已经观察到高水平的ROS产生、低ATP水平以及线粒体形态异常。
线粒体自噬缺陷与代谢疾病之间存在复杂的双向影响关系。一方面，线粒体自噬缺陷可能因能量供应减少和氧化应激过度的缘故导致代谢异常；另一方面，代谢疾病也可能引发能量匮乏，从而降低线粒体自噬的稳态活性。
其他
如CKLF诱导的缺陷性线粒体自噬会导致微胶质细胞激活和神经炎症，为治疗神经炎症性疾病提供了一种可能的方法。
线粒体自噬在多种疾病的发生发展中均扮演着重要角色。通过深入研究线粒体自噬与这些疾病之间的关联，可以为疾病的预防、诊断和治疗提供新的思路和方法。
线粒体自噬高分文献解读
题目：Mitophagy curtails cytosolic mtDNA-dependent activation of cGAS/STING inflammation during aging
杂志：Nature Communications
影响因子：IF=14.7
发表时间：2024年1月
研究背景：自噬是维持体内平衡的主要细胞内循环机制之一。线粒体自噬被定义为通过自噬机制去除有缺陷或多余的线粒体，可通过PTEN诱导的激酶1(PINK1)/Parkin途径、线粒体自噬受体或线粒体脂质组成的变化介导。巨噬细胞功能退化被认为是衰老过程的标志。随着生物体年龄的增长，生物组织中需要降解大量的衰老细胞碎片，以缓解溢出的细胞内容物造成的组织损伤，因此自噬水平的调控与衰老具有一定的相关性。在本研究中，研究人员对小鼠年龄相关的线粒体自噬变化进行系统分析，研究线粒体自噬与mtDNA引发的炎症之间的相互作用，并探索线粒体自噬促进策略缓解年龄相关生理衰退的潜力。
研究思路：研究人员首先在使用mito-QC报告鼠分析多个器官中的线粒体自噬时发现，老年鼠与年轻鼠相比，线粒体自噬要么增加要么不变。基于这一现象，研究人员接下来通过转录组分析老年鼠的视网膜中I型干扰素和cGAS/STING的关系。最后，研究人员利用线粒体自噬诱导剂尿素A(UA)进行干预去研究线粒体自噬的药理激活作用。
研究思路：研究人员首先在使用mito-QC报告鼠分析多个器官中的线粒体自噬时发现，老年鼠与年轻鼠相比，线粒体自噬要么增加要么不变。基于这一现象，研究人员接下来通过转录组分析老年鼠的视网膜中I型干扰素和cGAS/STING的关系。最后，研究人员利用线粒体自噬诱导剂尿素A(UA)进行干预去研究线粒体自噬的药理激活作用。
题目：CKLF induces microglial activation via triggering defective mitophagy and mitochondrial dysfunction
杂志：Autophagy
影响因子：IF=14.6
发表时间：2024年3月
研究背景：小胶质细胞是中枢神经系统中主要的固有免疫细胞，在中枢神经系统从胚胎期到成年期的稳态和发育中起着关键作用。在免疫原性刺激激活后，小胶质细胞转化为激活反应表型并发挥炎症功能，包括细胞因子和活性氧的产生增强，它们被认为是神经炎症的应答者和诱导剂，在各种中枢神经系统疾病的发病机制中发挥作用。
线粒体自噬是一种选择性的自噬形式，通过去除受损和冗余的线粒体，在线粒体质量控制中起着至关重要的作用。然而，线粒体自噬缺陷导致功能失调线粒体的积累，从而加剧氧化应激和炎症。大多数现有的研究都集中在研究病理刺激，如脂多糖、吗啡和可卡因对小胶质细胞有丝分裂的影响[。虽然一些研究已探讨细胞因子对小胶质细胞有丝分裂的影响，但趋化因子在这一过程中的作用很少被探讨。
CKLF/CKLF1(趋化因子样因子1)是一种cc型趋化因子，在多种疾病中发挥关键作用，包括缺血性卒中、超敏反应、肿瘤、心脑血管疾病和呼吸系统疾病。最近，研究人员发现CKLF C27肽暴露导致小胶质细胞代谢重编程，细胞外酸率增加、耗氧量减少、线粒体裂变增加，这表明CKLF暴露诱导的线粒体功能障碍可能与小胶质细胞的线粒体自噬有关。为验证这一假设，本研究旨在阐明小胶质细胞自噬在CKLF诱导的小胶质细胞激活和神经炎症中的作用，以及CKLF治疗后潜在的分子机制。
研究思路：研究首先通过对线粒体自噬标记物DNM1L、PINK1、PRKN和OPTN的检测，发现CKLF活性肽段C27可诱导小胶质细胞发生线粒体自噬，且呈现浓度和时间特异性。接下来，通过线粒体与自噬标记物的荧光共染和线粒体自噬试剂盒和透射电镜检测去探究C27和线粒体自噬体的降解障碍是否有关系。之后，研究人员探究线粒体自噬缺陷在C27诱导小胶质细胞激活中的生物学作用。
研究机制图：
题目：A mitophagy sensor PPTC7 controls BNIP3 and NIX degradation to regulate mitochondrial mass
杂志：Molecular Cell
影响因子：IF=16
发表时间：2023年12月
研究背景：线粒体自噬过程中，BNIP3和NIX（也称为BNIP3L）两种线粒体自噬受体发挥着重要作用。NIX介导的线粒体自噬在发育过程中上调，在缺氧条件下，BNIP3和NIX都被HIF1a转录上调，以去除过多的线粒体，使细胞适应低氧环境。鉴于其强大的线粒体去除能力，细胞BNIP3和NIX水平在正常状态下会受到严格控制。作者先前的研究发现，存在多个线粒体自噬抑制因子，其中包括FBXL4和PPTC7。作者发现FBXL4定位于线粒体外膜，与Skp1和Cullin1组成SCFFBXL4 E3泛素连接酶。SCFFBXL4通过泛素化BNIP3和NIX，然后被UBXD8-VCP复合物移位出膜进行蛋白酶体降解来抑制线粒体自噬。然而，关于BNIP3和NIX的降解是否以及如何被适应性调节以满足细胞需求的基本问题仍未得到解答。本文研究确定了PPTC7是一种线粒体自噬传感器，它整合了稳态和生理信号，动态控制BNIP3和NIX的SCFFBXL4依赖性降解，确保在各种条件下适当的线粒体数量控制和代谢稳态。
研究思路：
线粒体自噬研究现状
创新点
分子机制的揭示：PINK1/Parkin和FUNDC1等信号通路的发现为理解线粒体自噬的调控机制提供了新的视角。
潜在治疗靶点的发现：线粒体自噬相关蛋白可能成为新的抗癌治疗靶点。
生物标志物的开发：线粒体自噬相关蛋白的表达和活性可能作为肿瘤预后的生物标志物。
不足
调控机制的复杂性：线粒体自噬的调控网络仍然不完全清楚，需要进一步的研究来揭示其复杂的调控机制。
检测方法的局限性：目前缺乏直接和特异性的线粒体自噬活性检测方法。
临床应用的挑战：将线粒体自噬的研究成果转化为临床应用仍面临诸多挑战，包括药物开发、治疗策略的设计等。
参考文献
[1] Yao RQ, Ren C, Xia ZF, Yao YM. Organelle-specific autophagy in inflammatory diseases: a potential therapeutic target underlying the quality control of multiple organelles. Autophagy. 2021 Feb;17(2):385-401. doi: 10.1080/15548627.2020.1725377.
[2] Wang S, Long H, Hou L, Feng B, Ma Z, Wu Y, Zeng Y, Cai J, Zhang DW, Zhao G. The mitophagy pathway and its implications in human diseases. Signal Transduct Target Ther. 2023 Aug 16;8(1):304. doi: 10.1038/s41392-023-01503-7.
[3] Palikaras K, Lionaki E, Tavernarakis N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nat Cell Biol. 2018 Sep;20(9):1013-1022. doi: 10.1038/s41556-018-0176-2.
[4] Picca A, Faitg J, Auwerx J, Ferrucci L, D'Amico D. Mitophagy in human health, ageing and disease. Nat Metab. 2023 Dec;5(12):2047-2061. doi: 10.1038/s42255-023-00930-8.
[5] Lu Y, et al. Cellular mitophagy: Mechanism, roles in diseases and small molecule pharmacological regulation. Theranostics. 2023;13(2):736-766.
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