细胞死亡作为一种重要的生理过程，一直都是生命科学研究的热点。因为它对于理解疾病的发生和发展机制，以及开发创新的治疗方法至关重要。
除了常规的细胞死亡形式，泛凋亡、双硫死亡这两个非常有潜力的新兴细胞死亡研究方向也成了近期大家的关注对象。
今天我们就聊聊近来非常有“爆”点的细胞死亡形式——泛凋亡和双硫死亡。
从发生机制、检测方法，到研究思路、文献解读，都给大家总结好了！（篇幅较长建议收藏再看）
Part.1
泛凋亡
泛凋亡可以说是目前已知最复杂的细胞死亡形式，既包含细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡的特征，又不能被任何单一死亡形式表征，具有极高的研究价值和前景。
泛凋亡背景介绍
泛凋亡（PANoptosis）这一概念首次由美国学者 Malireddi 等人于2019年提出，用以描述那些无法仅通过任一传统程序性细胞死亡途径来充分解释的细胞死亡现象。
▲J Immunol. 2022;209(9):1625-1633.
DOI：10.4049/jimmunol.2200508
泛凋亡是一种炎症性程序细胞死亡，受到PANoptosome（泛凋亡体）复合物的调控。
它具有细胞焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）的关键特征。
泛凋亡不能被细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡中任意一种程序性细胞死亡（PCD）途径单独表征，它是一个综合了多种细胞死亡特征的过程。这便是PANoptosis术语中“P”、“A”和“N”的来源。
泛凋亡分子机制
▲Cell Death Dis 14, 851 (2023).
DOI: 10.1038/s41419-023-06370-2
PANoptosis的分子机制涉及多个方面，其中最重要的是PANoptosome（泛凋亡小体）复合物的组成和功能。
当遇到各种微生物感染和细胞稳态改变等触发因素时，包括 ZBP1、AIM2、RIPK1 和 NLRP12 在内的传感器可以相互作用并招募其他几种分子形成 PANoptosome。
这些PANoptosomes进一步诱导caspase-3/7活化、GSDMD和GSDME切割以及MLKL磷酸化，导致膜孔形成和PANoptosis进展。
🔷 构成PANoptosomes的蛋白可分为3种类型：
PAMPs或DAMPs传感器，如ZBP1、AIM2和NLRP3；
适配器，如ASC和FADD；
催化效应器，如RIPK1、RIPK3、CASP1和CASP8 。
🔷 目前的PANoptosomes主要有4种类型：
ZBP1-PANoptosome（ZBP1、NLRP3、ASC、caspase-1、caspase-6、caspase-8、RIPK1 和 RIPK3）；
AIM2-PANoptosome（AIM2、Pyrin、ZBP1、ASC、caspase-1、caspase-8、FADD、RIPK1 和 RIPK3）；
RIPK1-PANoptosome（RIPK1、RIPK3、NLRP3、ASC、caspase-1 和 caspase-8）；
NLRP12-PANoptosome（NLRP12、ASC、caspase-8 和 RIPK3）。
此外，这些PANoptosomes在某些条件下也可以由IRF1调控。在IAV感染或IFN加KPT330作用下，IRF1促进ZBP1表达和ZBP1-PANoptosome形成。
同样，在F. novicida感染下，IRF1负责AIM2-PANoptosome活化。在TAKi加LPS刺激下，IRF1作为RIPK1-PANoptosome的上游调节剂，在血红素加PAMPs或TNF刺激下，IRF1介导NLRP12-PANoptosome的形成。
泛凋亡研究思路
1）从疾病特征切入
PANoptosis在多种疾病的进程中扮演着重要角色。我们可以从疾病的特性出发，比如细菌、病毒和真菌的感染，口腔感染，炎症性疾病以及由热应激反应引起的炎性细胞死亡等角度进行探讨。
此外，某些疾病的核心细胞损伤或死亡也可能触发PANoptosis，例如视网膜神经节细胞（RGC）的死亡与青光眼的发生紧密相关。
▲泛凋亡相关的潜在疾病
2）从药物机制探索
在肿瘤及其治疗领域，许多化疗药物通过同时诱导细胞凋亡、坏死和焦亡来杀死细胞，从而抑制肿瘤的生长。
以奥沙利铂为例，作为胃癌的常规一线化疗药物，它能够触发这三种形式的细胞死亡。进一步的研究还可以探索这些药物的耐药机制，即为何在某些情况下PANoptosis的效果会减弱。
3）从目标基因视角
PANoptosome是启动三种程序性细胞死亡（PCD）途径的“总开关”，其结构由多个关键分子如ZBP1、NLRP3、ASC、FADD、RIPK1、RIPK3、CASP1和CASP8等通过特定的偶联和接合形成。
如果在研究中发现这些分子在特定疾病中的表达出现异常，那么将PANoptosis作为后续的研究方向将是一个值得尝试的策略。种疾病的进程中扮演着重要角色。
我们可以从疾病的特性出发，比如细菌、病毒和真菌的感染，口腔感染，炎症性疾病以及由热应激反应引起的炎性细胞死亡等角度进行探讨。此外，某些疾病的核心细胞损伤或死亡也可能触发PANoptosis，例如视网膜神经节细胞（RGC）的死亡与青光眼的发生紧密相关。
泛凋亡检测方法及指标
🔷 观察细胞形态：
1）细胞焦亡引起细胞质肿胀和膜破裂；
2）凋亡主要形态学特征包括：染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。
▲Comput Struct Biotechnol J. 2021 Aug 3;19:4641-4657. DOI：10.1016/j.csbj.2021.07.038.
🔷 检测不同 PCD 的关键蛋白（IHC/IF/WB）：每种PCD相关指标可选择1~3个，但必须包含3种PCD的指标！
1）焦亡相关：
Caspase-1、Caspase-4、GSDMD、AIM2/Pyrin/NLRP3 等；
2）凋亡相关：
Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、PARP、Bax/Bcl 等；
3）坏死性凋亡相关：
(p-)MLKL、(p-)RIPK1、(p-)RIPK3、Caspase-8等；
4）泛凋亡标志物还有：
感受器 ZBP1 和磷酸激酶 TAK1。
🔷 其他检测方法：
MTT/CCK-8 法、EdU 染色等检测细胞增殖活力；
JC-1线粒体膜电位检测、PI染色/AO染色、Annexin V/PI、TUNEL等方法检测凋亡；
ELISA 检测炎症因子的释放；
免疫印迹、流式等技术检测炎性小体NLRP3 表达和Caspase活化情况。
▲Mol Cell Proteomics. 2023;22(6):100551.
DOI：10.1016/j.mcpro.2023.100551
🔷 如何确定是泛凋亡在起作用，而不是这三种PCD途径？
可以分别利用焦亡(GSDME)抑制剂Disulfiram、Ac-DMPD/DMLD-CMK；凋亡抑制剂Z-VAD-FMK；坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1处理细胞或动物模型，去观察并检测上述指标的变化，无逆转则说明可能由泛凋亡调控三种PCD途径共同发挥作用。
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泛凋亡相文献解读
文献1：NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs
IF: 64.5
期刊：Cell
▲DOI：10.1016/j.cell.2023.05.005
胞质固有免疫传感器对宿主防御具有至关重要的作用，它们能够形成如炎症小体和泛光体这样的复合物，诱导炎症细胞死亡。尽管传感器NLRP12与感染性和炎症性疾病紧密相关，但关于其激活的具体触发因素以及它在细胞死亡和炎症过程中的确切作用仍知之甚少。
在本项研究中，研究人员揭示了NLRP12在血红素加PAMP或TNF的刺激下，能够驱动炎症小体和泛光体的激活，进而引发细胞死亡和炎症反应。TLR2/4通过IRF1介导的信号传导途径诱导了Nlrp12的表达，这进一步促进了炎症小体的形成，从而触发了IL-1β和IL-18的成熟。
值得注意的是，炎症小体还是更大规模的NLRP12泛光体复合物的关键组成部分，该复合物通过胱天蛋白酶8/RIPK3的机制驱动了炎症细胞死亡。在溶血模型中，实验表明Nlrp12的缺失能够显著保护小鼠免受急性肾损伤和致死性威胁。
综上所述，该研究确认了NLRP12是血红素加PAMPs介导的泛光症、炎症和病理过程中的重要胞质传感器，这表明NLRP12和该途径中的分子是溶血和炎症疾病的潜在药物靶点。
文献2：Integrated NLRP3, AIM2, NLRC4, Pyrin inflammasome activation and assembly drive PANoptosis
IF：24.1
期刊：Cell Mol Immunol
▲DOI： 10.1016/j.cell.2023.05.005
炎症小体作为先天免疫的重要防线，它们负责侦测病原体并触发感染细胞的死亡，对炎症、发育及癌症等生理过程具有重要影响。这些炎症小体传感器通过与适配器ASC及caspase-1结合，形成多蛋白复合物，进而检测和响应特定的病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）。
在疾病状态下，细胞会遭遇多种PAMPs和DAMPs，导致不同炎症小体的协同激活。然而，关于如何整合这些炎症小体传感器以实现最佳宿主防御的分子机制尚不清楚。本研究发现，多种配体同时激活炎症小体可触发不同类型的程序性炎症细胞死亡，且这种效果无法通过单一炎症小体的配体模拟。
更进一步，作者确定了NLRP3、AIM2、NLRC4和Pyrin与ASC、caspase-1、caspase-8和RIPK3共同构成了一个大型多蛋白复合物，该复合物驱动泛视症的发生。
此外，这一复合物还能释放到细胞外空间，并在多个炎症小体间保留，当被邻近的巨噬细胞吞噬后，可诱导炎症反应。
总之，本研究揭示了炎症小体传感器之间先前未知的调节联系和分子相互作用，这些作用促进了包含多个炎症小体传感器和细胞死亡调节剂的多蛋白复合物的组装。对NLRP3、AIM2、NLRC4和Pyrin之间关键相互作用的新发现，为理解这些分子在先天免疫和炎症小体生物学中的功能，以及确定针对NLRP3-、AIM2-、NLRC4-和Pyrin-介导疾病的新治疗靶点提供了重要思路。
文献3：ZBP1-dependent inflammatory cell death, PANoptosis, and cytokine storm disrupt IFN therapeutic efficacy during coronavirus infection
IF: 24.8
期刊：Sci Immunol
▲DOI：10.1126/sciimmunol.abo6294
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），即导致2019年冠状病毒病（COVID-19）的病毒，在全球大流行中继续造成大量发病率和死亡率。了解SARS-CoV-2感染期间先天免疫和炎症反应的基本机制，对于开发有效的治疗策略至关重要。
虽然基于干扰素（IFN）的治疗通常在病毒感染期间预期是有益的，但COVID-19的临床试验显示，在SARS-CoV-2感染期间，IFN治疗的疗效有限，并可能产生潜在的有害影响。然而，导致这种失败的根本原因尚不清楚。
在这项研究中，我们发现IFN诱导了人类和小鼠巨噬细胞以及感染β-冠状病毒（包括SARS-CoV-2和小鼠肝炎病毒MHV）的小鼠肺部中的Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）介导的炎症细胞死亡（PANoptosis）。在COVID-19患者中，与康复者相比，死于该疾病的患者免疫细胞中先天免疫传感器ZBP1的表达增加，这进一步表明ZBP1与病理之间存在联系。在小鼠中，β-冠状病毒感染后的IFN-β治疗增加了致死率，而Zbp1或其Zα结构域的基因缺失抑制了细胞死亡，并保护小鼠免受β-冠状病毒感染期间IFN介导的致死性。
总的来说，我们的结果表明，冠状病毒感染期间诱导的ZBP1通过驱动炎症细胞死亡和致死性限制了IFN治疗的疗效。因此，抑制ZBP1活性可能会提高IFN治疗的疗效，为开发COVID-19以及其他发生IFN介导的细胞死亡和病理的感染和炎症条件的新型且急需的治疗药物铺平道路。
Part.2
双硫死亡
双硫死亡 (Disulfidptosis) 是 2023 年 MD 安德森癌症中心甘波谊教授和陈俊杰教授团队发现的新型细胞死亡。
▲2023年3月 《Nature Cell Biology》 杂志上的研究论文Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis中被首次报道。
自发现以来，备受众多学者瞩目，相关研究热度持续不减，相关研究的文章数量更是逐年上涨。
双硫死亡的定义
双硫死亡（Disulfidptosis）是一种由SLC7A11介导的细胞内过量胱氨酸积累引起的二硫化物（例如二氧化硫、硫化氢等）应激导致的新型细胞死亡方式。
这种死亡方式独立于现有的凋亡（apoptosis）、铁死亡（ferroptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）、铜死亡（cuproptosis）等细胞程序性死亡类型。
双硫死亡3大特征：xCT 高表达、NADPH 耗竭、肌动蛋白丝 (F-actin) 萎缩。
下图为双硫死亡机制模式图：
双硫死亡的过程
①在葡萄糖匮乏的条件下，SLC7A11高表达的癌细胞会大量摄入胱氨酸。
②由于NADPH供应不足，胱氨酸无法被及时还原为半胱氨酸，导致二硫化物在细胞内异常积累。
③二硫化物应激诱发肌动蛋白细胞骨架蛋白之间的异常二硫键交联和细胞骨架收缩。
④细胞骨架的收缩和异常二硫键交联干扰了细胞骨架的组织，导致肌动蛋白网络崩溃。
⑤最终，细胞因无法维持正常形态和功能而发生死亡。
双硫死亡的机制
双硫死亡的必要条件为：
1）细胞处于葡萄糖耗竭状态
俗点说就是让细胞处于“饥饿”状态。
2）SLC7A11的高表达
溶质载体（Solute Carriers, SLC）转运蛋白家族对葡萄糖、氨基酸和金属离子的转运过程中发挥着重要的作用。
SLC7A11是介导细胞的胱氨酸摄入的重要转运体蛋白，其在维持细胞内谷胱甘肽水平和保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡的同时，还具有一定的毒性，要消除这种毒性需要大量消耗葡萄糖磷酸戊糖途径生成的NADPH，否则将因过度积累二硫化物而引起细胞死亡，这也说明了SLC7A11是把“双刃剑”。
葡萄糖饥饿引发的NADPH 耗竭，及SLC7A11的高表达造成的胱氨酸高摄取和半胱氨酸减少、二硫化物细胞内积累引起的二硫应激，从而激活了Rac1-WRC-Arp2/3信号通路，导致肌动蛋白细胞骨架蛋白和二硫化物沉积中的异常二硫键（如下图所示）：
肌动蛋白细胞骨架蛋白之间产生异常二硫键、肌动蛋白收缩和与质膜分离，最终导致细胞收缩和死亡（如下图所示）：
这里补充一下SLC7A11相关内容：
双硫死亡的关键因子就是SLC7A11。
不知道从哪里入手的同学，可以试以SLC7A11为主要研究对象，对其表达机制进行研究和干预、后续也可对SLC7A11的蛋白水平、修饰、互作等入手。
SLC7A11作为一个膜上的转运蛋白，会把膜外的胱氨酸转入细胞内，把细胞内的谷氨酸转运到细胞外。而胱氨酸，会通过形成半胱氨酸，通过谷胱甘肽代谢途径，转化为GSH，GSH则是抑制铁死亡的关键分子。
但是在另一方面，胱氨酸转化为半胱氨酸的过程中，需要有NADPH的参与。而NADPH是通过葡萄糖的磷酸戊糖途径产生的，而糖酵解的关键，就是葡萄糖的摄入：
当细胞遇到葡萄糖饥饿，即葡萄糖摄入不足的情况下，细胞内通过PPP途径产生的NADPH的量降低。同时SLC7A11在膜上表达增多，则胱氨酸无法转化为半胱氨酸，这就造成了细胞内胱氨酸的累积：
双硫死亡的主要代谢通路
其实上面的内容已经提到了代谢过程，这里在给大家做一下总结：
1）胱氨酸代谢：
如胱氨酸的转运、胱氨酸-半胱氨酸循环：胱氨酸通过SLC7A11进入细胞质后，经转化变为半胱氨酸，用于合成细胞对抗氧化应激的关键原料---谷胱甘肽。
2）NADPH代谢：
己糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（G6P），从而启动戊糖磷酸途径（Pentose phosphate pathway, PPP），该途径分为氧化和非氧化两个阶段，NADPH主要在氧化阶段通过三个不可逆反应产生。
3）RAC1-WRC通路：
这一途径被细胞二硫应激所激活。RAC1过表达激活NCKAP1，导致WRC与其他亚基包括WAVE-2、CYFIP1、Abi2和HSPC300组装成复合体，调节肌动蛋白聚合和板足的形成。然而，它们在细胞骨架重组、细胞迁移和双硫死亡机制中发挥关键作用。
双硫死亡检测方法
1）形态学观察
利用透射电镜观察细胞内部结构，双硫死亡的特征：细胞因细胞膜收缩、内容物丢失等出现体积缩小。细胞器如线粒体、内质网和高尔基体发生肿胀、膜结构的破坏或消失。细胞核凝聚、断裂或核膜消失。细胞质变得致密，细胞内结构变得模糊不清。在某些情况下可能伴随着自噬体形成来试图清除受损成分。
2）检测SLC7A11的表达
利用PCR、Western Blot、IHC检测SLC7A11是否高表达。
3）观察F-actin的形态变化/收缩
利用免疫荧光观察F-actin的收缩、表达。
4）NADPH耗竭
利用试剂盒检测NADP+/NADPH比例。
5）检测骨架蛋白的二硫键水平
利用Western Blot、质谱检测骨架蛋白的二硫键水平变化。
6）检测细胞死亡率
利用PI单染/Tunel染色检测细胞死亡率。
7）双硫死亡激动剂
了解了双硫死亡的具体形成机制，我们可以通过对SLC7A11高表达的细胞进行葡萄糖剥夺来诱导其发生双硫死亡，如利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）抑制剂RRx-001、葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）抑制剂BAY-876、KL-11743等减少葡萄糖的摄取及转运以耗竭NADPH。
双硫死亡相关疾病研究
双硫死亡的发现源自于肿瘤细胞的“高产出、高风险”的工作模式。因此在癌症、氧化应激相关疾病的研究中具有潜在的应用价值，尤其是在针对那些表达高水平的胱氨酸转运蛋白SLC7A11（也称为xCT）的癌细胞中。
SLC7A11的高表达导致细胞对葡萄糖剥夺敏感，从而引发双硫死亡。以下是双硫死亡可能在疾病研究和应用中的几个方面：
1）癌症治疗：
由于双硫死亡在SLC7A11高表达的癌细胞中被诱导，这为开发新的抗癌疗法提供了可能。通过靶向双硫死亡，可以设计出选择性杀死癌细胞而不影响正常细胞的治疗方法。例如，使用葡萄糖转运抑制剂（如BAY-876）可以诱导SLC7A11高表达的癌细胞发生双硫死亡，从而抑制肿瘤生长。
2）代谢应激研究：
双硫死亡与细胞内二硫化物的异常积累和NADPH的消耗有关。研究双硫死亡可能有助于理解在代谢应激条件下，如糖尿病、肥胖和其他代谢紊乱疾病中，细胞如何响应和适应这些应激。
3）药物筛选和开发：
通过研究双硫死亡的机制，可以筛选出能够诱导或抑制这一过程的小分子化合物，为开发新的治疗药物提供基础。
4）生物标志物的发现：
研究双硫死亡可能有助于发现与特定疾病相关的生物标志物，这对于疾病的早期诊断和治疗监测具有重要意义。
5）细胞死亡机制的深入理解：
双硫死亡的发现扩展了我们对细胞死亡方式的认识，有助于深入理解细胞如何在不同的应激条件下维持生存或走向死亡。
6）其他疾病的潜在治疗：
虽然双硫死亡主要在癌症治疗中被研究，但其机制可能对其他疾病（如神经退行性疾病、心血管疾病等）的治疗也有潜在影响，特别是在那些涉及氧化应激和细胞死亡的病理过程中。
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参考文献
https://mp.weixin.qq.com/s/BgBzob4SHgVnxrUy3NDJxQ
https://mp.weixin.qq.com/s/WuhWoJ340cttF18XosTBOg
https://mp.weixin.qq.com/s/Zo7OBzc69jT9R07l2ktNPw
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