EMSA（凝胶迁移实验）是一种检测蛋白质和核酸序列相互结合的技术；可用于核酸与蛋白相互作用的定性和定量分析。EMSA适用于在初步研究蛋白与核酸相互作用时使用。
1）EMSA研究对象
DNA和蛋白相互作用以及RNA和蛋白相互作用。
01
用于研究DNA结合蛋白和特定的DNA序列的相互作用；
02
可用于DNA定性和定量分析；
03
用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
2）EMSA实验原理
EMSA是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。蛋白质与核酸分子结合后将大大增加其相对分子质量，而凝胶电泳中核酸的迁移率与其相对分子质量成正比。
因此没有结合蛋白质的核酸片段跑得快，而与蛋白质结合形成复合物的核酸则跑得慢；在显影上滞后的电泳条带则表明荧光核酸探针与蛋白质产生了结合。
3）EMSA实验设计流程
根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。
①材料准备-荧光探针合成
目前常用的荧光标记有5(6)-FAM（羧基荧光素）、FITC（异硫氰酸荧光素）标记和 P32放射性同位素标记等。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。因为同位素标记探针具有非常短的半衰期并且对人的健康有害，而生物素标记更稳定、准确和方便，且亲和力高。
②材料准备-蛋白的纯化
可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。
③材料准备-PAGE胶的配制
凝胶配制→加入凝胶→凝胶凝结。
④孵育电泳
添加体系→样品孵育→上样电泳
⑤凝胶显影
化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。
3）EMSA 结果分析
结果解读示范：
文献：WRKY71 accelerates flowering via the direct activation of FLOWERING LOCUS T and LEAFY in Arabidopsis thaliana.
作者在FT和LFY启动子上游筛选到9个WRKY71的潜在结合位点（I-IX），通过EMSA验证WRKY71与上述位点的互作。经过实验证明，II、III、IV位点与WRKY71存在特异性互作，I位点与WRKY71不互作。
5）EMSA实验注意事项
① 核酸探针避光存放；
② 蛋白样品低温存放；
③ 蛋白样品加抑制剂；
④ 样品孵育充分混匀；
⑤ PAGE凝胶预电泳；
⑥ 上样前冲洗泳道孔；
6）EMSA实验优缺点分析
①EMSA实验优点
🔹相较于CHIP和RIP，EMSA具有更简单的操作步骤，更短的实验周期，约一天内可完成，简单快捷。
🔹可以较真实的模拟蛋白质与核酸在体内互作的机制与过程。数据重复性好，结果可靠。
🔹可以检测的核酸分子大小和结构（单链、双链、三链、四链、环状核酸）范围很广，并可提供蛋白结合在核酸上的准确序列位置。
🔹在合适的条件下，在单个反应体系中就可以通过不同复合物的形成，检测不同蛋白与不同核酸分子之间的结合情况。
🔹能检测的蛋白大小范围很广，从寡肽到转录因子复合物都能检测，并且该实验既可以使用纯蛋白也可以使用细胞提取物。
②EMSA实验缺点
🔹一次实验仅能验证少数的核酸序列信息，通量低。CHIP和RIP实验通过目标蛋白分离以及高通量测序，可以得到海量的互作核酸序列信息。
🔹EMSA基于蛋白天然构象与核酸的某一段区域结合而发生相互作用。因此不能找到具体蛋白的何种氨基酸位点或区域，与核酸的片段相互作用。结果有局限性。
🔹EMSA在很大程度上属于定性实验，比如：可以检测蛋白-DNA复合物的形成与否，并不能精细的检测结合反应的上调或下调。
🔹无法衡量电泳过程中的化学平衡，在电泳过程中发生的快速解离会影响对复合物的检测。
🔹在EMSA实验中，复合物的形成与许多因素有关，并不能直接反映分子大小或者鉴定复合物中的各种蛋白质。
🔹EMSA实验中并不考虑体内环境中影响蛋白DNA结合的因素，比如染色质的结构对复合物形成的影响，因此即使EMSA实验结果反映蛋白可以与DNA结合，在体内环境中也许还需要其它条件才能完成结合反应。
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