2024年09月07日，浙江大学李福勇研究员联合爱尔兰科克大学Jens Walter团队在《Microbiome》发表研究型文章“Highly accurate and sensitive absolute quantification of bacterial strains in human fecal samples”，该研究认为使用基于试剂盒的DNA提取方法的qPCR是准确定量粪便样本中肠道细菌至菌株水平的最佳方法。提供的分步方法将允许科学家为L. reuteri和其他细菌分类群的细菌菌株的准确定量，设计高度敏感的菌株特异性PCR系统，适用于广泛的样本类型。人类肠道微生物群是一个由细菌主导的复杂微生物群落，在宿主的生理和健康中扮演着重要角色，包括免疫系统的发展、对病原体的定植抗性、营养利用和神经发育。微生物群落的改变（通常称为菌群失调）与多种疾病有关，包括肠道疾病和一系列慢性疾病。因此，表征肠道微生物组成对于探索其在宿主生理中的作用以及开发旨在调节微生物群以改善健康策略至关重要。由于许多微生物功能能力是菌株特异性的，确定和定量个别菌株对于建立特定肠道微生物群与宿主生理状态之间的联系至关重要。
大多数微生物组研究依赖于下一代测序（NGS）来表征微生物群落，这在过去二十年中彻底改变了该领域。然而，NGS数据的局限性在于它是组成性的（因此只是半定量的），并且动态范围有限且灵敏度低。许多研究表明特定物种或菌株的绝对丰度发生了变化，影响了宿主生理，这表明了定量和敏感检测方法的重要性。包括定量方法如定量PCR（qPCR）和流式细胞术可以使NGS数据更加定量，但数据仍然是组成性的且检测限高。因此，需要定量技术准确和敏感地检测和绝对定量特定微生物物种或菌株。qPCR已被广泛用于定量胃肠道微生物群的成员在菌株水平。然而，qPCR有几个局限性：它可能受到PCR效率的影响并依赖于外部标准，以及它容易受到环境或粪便样本中存在的抑制剂的影响。与qPCR相比，液滴数字PCR（ddPCR）被认为是一种更准确和敏感的方法，不需要校准曲线。ddPCR基于在成千上万的纳升级PCR反应中对目标进行单独扩增。它已被应用于检测临床样本中的微量核酸靶标，以及定量环境和动物样本中的微生物。然而，qPCR和ddPCR在检测和定量人类粪便样本中目标微生物方面的性能尚未进行系统评估和比较。此外，迄今为止尚未发布详细且标准化的菌株特异性PCR引物设计和验证工作流程。本研究的总体目标是设计一种基于PCR优化的方法，用于定量检测人类粪便样本中的细菌菌株，涉及灵敏度、准确性、重复性、时间和成本。为了实现这一点，系统地比较了qPCR和ddPCR与三种成熟的DNA提取方法结合使用，用于人类粪便样本中L. reuteri菌株的菌株特异性定量。基于这些比较，开发了一个易于遵循的分步方案，用于菌株特异性qPCR检测，包括识别菌株特异性标记基因和设计及验证引物。应用这个方案来设计两种L. reuteri菌株的菌株特异性qPCR检测，并通过添加粪便样本以及从接受活L. reuteri的人类受试者收集的样本来验证PCR检测，允许直接比较qPCR和NGS方法。关于比较和优化用于人类粪便样本中细菌菌株定量检测的两种PCR技术：定量PCR（qPCR）和液滴数字PCR（ddPCR）1. DNA提取方法的比较：研究比较了三种DNA提取方法（PC、PQ和QK），发现基于试剂盒的方法（PQ和QK）提取的DNA质量更高。2. qPCR与ddPCR的比较：在检测和定量粪便样本中的L. reuteri DSM 17938方面，ddPCR在重复性方面略优于qPCR，但当使用适当的DNA提取方法时，qPCR的性能可与ddPCR相媲美，且成本更低、速度更快。
3. 线性和灵敏度：两种技术在基于试剂盒的DNA提取方法（QK和PQ）下都显示出高线性和灵敏度。当使用PC方法时，两种技术的线性和灵敏度都有所下降。
4. 准确性：通过恢复率评估qPCR和ddPCR的准确性，发现PQ方法在提取L. reuteri的DNA时效率更高。
5. 成本：ddPCR的成本几乎是qPCR的四倍，且所需时间更长。
6. 优化的qPCR方法：研究基于上述发现和先前的研究，开发了一个分步的qPCR检测设计协议，用于准确定量人类粪便样本中的细菌菌株。
7. 菌株特异性qPCR检测的验证：使用为两种L. reuteri菌株（PB-W1和DSM 20016 T）开发的PCR检测，验证了该协议。这些检测在添加粪便样本和人类受试者样本中显示出高度的准确性和敏感性。
8. 与NGS方法的比较：在人类试验中收集的粪便样本中，qPCR检测与16S rRNA基因测序和全基因组测序（WMS）方法进行了比较，qPCR在检测和定量L. reuteri方面表现更好。
综上所述，该研究推荐使用PQ DNA提取方法与qPCR结合作为量化人类粪便中L. reuteri的最佳策略，并提供了一个详细的qPCR检测设计方法，以便准确定量不仅L. reuteri还有其他细菌分类群的细菌菌株。图1 设计和验证菌株特异性引物的主要步骤的流程图。
图2 基于三种不同的DNA提取方法，L. reuteri DSM 17938实际添加的细胞数/g与qPCR和ddPCR检测方法测得的细胞数/g之间的关系。
图3 qPCR 和 ddPCR 的准确性（以回收率表示）。图4 在向粪便样本中添加的L. reuteri细胞数量与使用我们设计的PB-W1 qPCR检测方法测量到的细胞数量之间的线性关系。文章描述了一种具有高重复性、线性和准确性的菌株特异性qPCR检测方法，它在动态范围、成本和时间方面进一步超越了ddPCR。考虑到所有这些因素，建议将qPCR与基于试剂盒的DNA提取方法相结合，作为在人类粪便样本中定量肠道微生物成员至菌株水平的最佳选择。这里描述的菌株特异性引物设计以及体外和实验验证的分步方案将有广泛的应用，供科学家从各种情况（不仅是粪便样本，还包括其他肠道样本，如活检和拭子样本）中检测和定量各种细菌菌株，包括但不限于评估益生菌和活生物治疗剂的持久性、检测病原体或其他与疾病相关的微生物、在垂直传播和粪便微生物群移植过程中追踪细菌菌株以及确认和建立低生物量样本中的细菌负荷。通讯作者
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李福勇，浙江大学第一类百人计划研究员，博士生导师，国家高层次青年引进人才。研究方向：消化道功能微生物组与宿主的交互作用。本科毕业于西北农林科技大学，之后获得欧盟伊拉斯谟世界计划全额奖学金并取得荷兰瓦赫宁根大学和维也纳农业大学动物遗传育种专业双硕士学位，硕士毕业后获得全额奖学金在加拿大阿尔伯塔大学攻读博士学位。博士毕业后在阿尔伯塔大学从事博士后研究；入职浙江大学前受聘于香港城市大学传染病与公共卫生系，任动物营养方向助理教授、独立PI、博士生导师。长期致力于消化道功能微生物组这一国际前沿领域的研究，聚焦本领域热点，结合多组学技术（包括宏转录组学、宏基因组学、宏代谢组学、比较基因组学等）、分子微生物学技术及经典微生物学技术，阐释了消化道微生物与宿主在营养和遗传层面的交互作用，在Microbiome、iMeta、Pharmacological Research、BMC Biology、Cell Host and Microbe、ISME等国际权威学术期刊发表论文超过30篇。现担任Microbiome杂志（微生物领域知名期刊）Associate Editor；长期担任Microbiome、Nature Communications、mSystems等知名期刊审稿人。在海外留学、工作期间曾先后13次获得欧盟、加拿大阿尔伯塔省政府、阿尔伯塔大学等机构授予的荣誉和奖励。![]()
Jens Walter，爱尔兰科克大学生态学、食品和微生物组的教授，同时也是APC微生物组爱尔兰的成员。他的专长位于肠道微生物组的进化生态学与人类营养学的交汇处。他的研究集中在塑造宿主-微生物共生关系的进化和生态过程，以及将基础微生物组科学转化为治疗和营养策略。Walter博士及其合作者开创性地应用生态理论来阐明塑造肠道微生物组的生态和营养因素，并通过饮食策略和活体微生物实现了微生物组的有针对性调节。Walter教授发表了超过140篇同行评审的出版物（谷歌学术H指数69，引用超过23,000次）。
