翻团出品 | 肠道微生物组组成：与健康一级亲属未来克罗恩病发病有关？（下）

虽然MRS是基于肠道微生物组的构成建立的，并初步揭示与CD 发生可能有关的菌群种类，但这些特定菌群的生物学功能并不清楚。

为了了解与CD发生有关的肠道菌群功能，研究人员使用PICRUST2对微生物组数据进行了功能分析。通过这种算法，对整个队列（n= 3483）的MRS 进行了功能通路的相关性分析。该分析发现46 种信号通路（总共409种）相关系数abs(ρ) > 0.25 ，校正的错误发现率p 值< 0.05 。与MRS显著相关的处于前10位的信号通路均呈负相关，包括还原性乙酰辅酶A 途径、霉菌酸生物合成途径、棕榈油酸合成途径I途径、油酸合成途径IV途径、硬脂酸合成II途径、脂肪酸合成起始的超级途径、5z -十二烯酸生物合成I途径 、棕榈酸生合成途径、8-氨基-7-氧化壬酸合成I途径和生物素合成I途径。

虽然之前的研究显示PICRUSt2计算的代谢组学数据与其相应的鸟枪法测序的数据之间存在高度的一致性，但是PICRUSt2计算可能存在计算偏差。此外，PICRUSt2和鸟枪法测序的数据只提供关于肠道菌群中潜在相关的基因组信息，并不一定与整体的蛋白质组学或代谢组学相关。

鉴于这个原因，为了进一步了解CD前期的受试者肠道微生物组如何发挥功能，研究人员将56名后来发展成 CD 的受试者和66名持续健康的受试者置于一个队列 (n = 122)，对其基线的粪便代谢组学进行分析 。后来发展成 CD 的受试者组(n = 56) 与FDR 持续健康的对照组 (n = 66)在年龄、性别、随访时间和地理分布上以1:1匹配。

通过分析发现24种代谢物(共1029种粪便代谢物) 存在显著性差异，与MRS的相关系数 abs (ρ) > 0.25，p < 0.05 。前10位最相关的代谢物均与 MRS 呈负相关，包括胞嘧啶，N，N，N-三甲基-L-丙氨酰L-脯氨酸甜菜碱(TMAP) ，胞苷，2,3-二羟基异戊酸，龙胆酸，烟酸，鸟嘌呤，木糖，8-羟基鸟嘌呤和 β-丙氨酸。

由于肠道炎症可能影响微生物组的构成，研究还评估了MRS与肠道炎症标志物的可能关系。采用粪便钙卫蛋白作为肠道炎症的指标，在同一个粪便样本中进行粪便钙卫蛋白水平的检测和16S 测序。通过Cox比例风险模型在验证队列对MRS 进行评估，该验证队列由微生物组的构成数据和粪便钙卫蛋白测量值(n = 1,109)组成。粪便钙卫蛋白> 120 μg／g 作为肠道炎症的参考值。

在粪便钙卫蛋白数据的验证集中，通过Cox比例风险模型发现MRS的HR 为1.51/SD, 95％置信区间[1.01-2.08] , p=0.011 。当我们使用相同的数据集将粪便钙卫蛋白指标包括在模型中时，MRS的HR为1.42/SD, 95％置信区间[ 1.01-2.08] , p=0.041。

值得注意的是，在平均6.0年、最长14年的随访期间，虽然大多数持续健康的受试者（93 %，555 例中的515例）粪便钙卫蛋白水平> 120 μg/g ，但一直没有症状。为了进行敏感性分析，我们在低钙卫蛋白水平的FDRs亚组（FCP<120μg/g）进行MRS验证分析。与整个验证队列（1.51/ SD, 95% CI 1.10-2.08)相比， 该亚组的MRS 风险比（1.29/SD， 95% CI 0.72-2.31）显示出较好的一致性， 但无统计学差异。最后，将粪便钙卫蛋白阈值设为50或100μg/g进行敏感性分析，结果也基本一致。

研究人员通过PICRUST2进一步评估了微生物组功能及其与MRS的关系。与MRS呈负相关的微生物组信号通路是生物素合成（Rho=-32.0%，FDR校正后p=3.1x10-84）。生物素（维生素B7或H）是人类通过饮食摄人获得的微量营养素，也由肠道细菌产生。包括维生素B7 缺乏在内的微量营养素缺乏在炎症性肠病患者中已有报道。也有实验表明，补充生物素可减轻小鼠结肠炎模型中的肠道炎症。

第二个有趣的功能通路是β-(1,4)-甘露聚糖降解通路(Rho=-31%, FDR校正后p = 2.3x10-78) ，也与MRS呈负相关。作为半纤维素和增稠剂，β-(1,4)-甘露聚糖广泛存在于人类饮食中。β-(1,4)-甘露聚糖对人类酶降解具有抗性，几乎完全由肠道菌群处理。β-(1,4)-甘露聚糖已成为一种流行的益生元，用于抵抗粘蛋白降解，保护肠道上皮粘液层。但如果微生物对β-(1,4)-甘露聚糖降解功能降低，即使通过饮食增加β-(1,4)-甘露聚糖的摄入，也不能发挥其作用。

研究还发现在子集队列中粪便代谢组学与MRS相关。与健康对照组相比，CD患者中减少的胞嘧啶及其衍生物胞苷与MRS呈明显负相关(Rho=-0.39, p=1.2×10-5；Rho=-0.35, p =8.2×10-5)。此外，MRS与抗炎或抗氧化活性的代谢物减少有关。具体而言，龙胆酸和烟酸与MRS呈负相关(0.26<rho<0.31, 3.2×10<="" span="">-4<p-value<2.3×10< span="">-3)。既往研究发现，烟酸盐，也称为烟酸或维生素B3，可抑制炎症，并具有抗氧化特性。而龙胆酸则具有广泛的抗炎、抗氧化和抗菌特性。与健康对照组相比，IBD患者显著缺乏者两种代谢物。这些发现表明，肠道微生物组产生抗炎代谢物的减少可能先于CD的发生。有趣的是，这些保护性代谢产物也与普拉梭菌属和毛螺菌（CD前期的主要改变的微生物组构成）的丰度呈正相关，这表明这些代谢物的含量和微生物组构成之间有潜在的相互作用。

相反，代谢组学数据显示12/13-肉豆蔻酸甲酯(A15:0 或I15:0)和14/15-棕榈酸甲酯(A17:0 or I17:0)丰度较高，其MRS较低(Rho= 0.27, p =3.0×10-3; Rho= 0.26%, p =4.3×10-3)。这些代谢物属于鞘脂类有机化合物，一旦被细菌合成，就可以作为信号代谢物与宿主进行交流。先前研究发现炎症性肠病患者的鞘脂含量显著增加。此项研究表明，鞘脂丰度的改变可能在CD发生之前就已经存在。这些高危代谢物与MRS呈正相关，表明微生物组构成对代谢物丰度和疾病发生风险均有影响。

最后，非靶向代谢组学分析还识别出N,N,N-三甲基丙氨酰脯氨酸甜菜碱(TMAP) ， 其与MRS 呈负相关(Rho=-0.35, p=7.9×10-5)。虽然最近的研究明确了TMAP的结构，但对其生物活性知之甚少。进一步的研究将需要探索TMAP如何参与CD 的发病。值得注意的是，79种代谢物看似与CD发生相关(p<0.05)，但是可能是由于本研究分析的样本量较小。需要对更大的样本进行研究，以验证这些结果。

值得注意的是，一部分健康的FDR在招募时可能已经有亚临床的肠道炎症。然而，当我们将粪便钙卫蛋白指标纳入模型时，MRS产生的HR为1.42 SD, 95% CI [1.02-1.98]，p=0.041。风险比的轻微下降表明MRS 不会因粪便钙卫蛋白升高所反映的亚临床肠道炎症的存在与否在而产生很大的偏移。值得注意的是，当校正连续变量FCP的水平时，我们发现了FCP与CD发生风险并非呈线性关系。在未来的研究中，应进一步探索对连续性变量FCP的非线性和线性权重的调整，以适当地解释这种非线性关系。

本研究的另一个潜在局限性是，研究结果是基于健康的FDR人群，因此可能不适用于普通人群。此外，尽管MRS在统计学上与CD的发病相关， 但MRS的预测效能仍然有限，这表明微生物组构与其他诸多因素相关，如遗传风险、饮食模式，这些可能改善健康FDR中CD 发病的风险。最后，我们只能随访单个时间点，那些导致疾病的菌群动态变化可能无法捕捉。此外需要进行实验研究，以评估本研究中提出的相关性是否是CD发病机制或对CD发生有影响。

总之，本研究首次证明肠道微生物组构成与CD的发病相关，这表明肠道微生物组构成是CD发病机制中的一个重要因素。根据预测模型，进一步证明了某些特定的微生物组构成可以预测个体发生CD的风险。微生物组在疾病发生中的作用在一个独立的队列中得到了验证，并在对粪便钙卫蛋白的测量进行调整后仍然相关。

即使在CD发病前五年以上进行MRS评估，MRS仍然具有一定的预测效能。将MRS与其他生物标志物整合以明确危险分层，仍有待于在未来的研究中探索。了解与CD发生风险相关的生物标志物，以及与发病机制相关的这些生物标志物的生物学作用，对于识别高危人群的预防新策略和改善已确诊患者的治疗都是非常必要的。