翻译：徐文博
1、简介
自 COVID-19 大流行以来，非药物干预措施 (NPI) 已有效遏制 SARS-CoV-2 的传播，同时还减少了许多病毒和细菌感染在儿童中的传播。然而，随着与大流行相关的预防措施的放松，人们发现，长期低水平接触病毒或细菌会导致各种病原体的感染水平增加，导致严重疾病的发病率比封锁前更高。在中国肺炎支原体感染激增，伴随着重症、难治性肺炎支原体感染，严重影响儿童的生活质量，甚至可能危及他们的生命。众所周知，病原体肺炎支原体（MP）属于一类缺乏细胞壁的原核微生物。它们可以粘附在呼吸道上皮上，引发氧化应激反应并导致呼吸道粘膜损伤。MP通常与 14 岁以下儿童和青少年的呼吸道疾病有关，约占儿童呼吸道感染的 40% 。MP感染与一系列急性和慢性呼吸道疾病相关，其中支气管炎是最常见的。除了呼吸道感染外，MP感染还可导致广泛的肺外表现，影响几乎所有器官。MP已知的致病机制包括细胞粘附和细胞毒性，导致炎症反应和免疫逃避，其中细胞毒素发挥着重要作用。
2. CARDS TX的发现和结构表征
MP感染的第一步是病原体粘附到宿主的呼吸道上皮细胞上。当试图表征 MP 与宿主细胞粘附过程中释放的细胞毒性因子时，观察到 MP 与细胞表面蛋白 A (SP-A）以剂量和钙依赖性方式。亲和层析表明与SP-A结合的MP蛋白分子量为68 kDa；经过序列分析后，最初将其命名为 MPN372，随后更改为 CARDS TX 。
CARDS TX 由 591 个氨基酸组成，在催化位点（残基 1-226）与百日咳毒素的催化 S1 亚基具有 27% 的同一性，而其余 365 个残基与其他蛋白质没有序列相似性。CARDS TX的三维结构分为两个主要部分，即N端mART结构域（D1）和两个C端β-三叶形结构域（D2+D3）。D1 结构域具有 ADP-核糖基转移酶活性，而 D2 和 D3 结构域促进蛋白质的结合和内化，从而负责受体相互作用。这两部分通过容易被酶裂解的二硫键连接。CARDS TX 的这种结构决定了蛋白质的双重活性，允许适应蛋白质靶标，并导致细胞毒性作用。
3.CARDS TX的功能及致病机制
CARDS TX 通过受体与宿主细胞表面结合介导的相互作用以在细胞表面或细胞内发挥其作用。然而，研究发现在缺乏SPA的哺乳动物细胞中，CARDS TX仍然表现出细胞毒性，表明细胞膜上还存在除SP-A之外的受体。免疫荧光分析揭示了 CARDS TX 和膜联蛋白 A2 (AnxA2) 在细胞膜上的共定位，并且随后显示 CARDS TX 以浓度依赖性和可饱和的方式选择性地结合到细胞表面和细胞内 AnxA2 。除了特异性受体 SP-A 和 AnxA2 之外，CARDS TX 还与磷脂酰胆碱和鞘磷脂特异性结合，其亲和力高于其他膜脂。利用荧光和生物素标记的rCARDS TX研究其细胞内转运，发现该毒素通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主靶细胞。随后，一部分毒素逃脱了溶酶体降解，从早期和晚期内体转移到高尔基复合体，并利用 CARDS TX 独特的 KELED 序列反向转运到内质网，集中在核周区域（见图 1）。
免疫电镜显示CARDS TX在MP的整个表面表达，其余的CARDS TX在MP细胞质中表达。rCARDS TX 免疫诱导了针对 CARDS TX 和 MP 本身的特异性抗体反应，证实了 CARDS TX 的表面位置及其促进 MP 粘附到上皮细胞的能力。近年来发现宿主细胞中CARDS TX的胞内分布受温度和时间的影响。4℃培养时，毒素分布在宿主细胞表面，37℃培养2小时后，可见到细胞质中。4小时后，观察到内化的毒素被转运至细胞核，16小时后，大部分毒素集中在核周区域。此外，细胞内毒素的水平受到宿主环境的调节。例如，在MP感染哺乳动物细胞期间，发现与SP-4肉汤培养物相比，CARDS TX的浓度有所增加。
3.1. CARDS TX 的 ADP-核糖基转移酶活性
CARDS TX 的 N 端区域包含残基 1-205，形成 mART 结构域。与大多数细菌ADP-核糖基转移酶类似，CARDS TX的N端区域包含三个保守序列，即催化谷氨酸残基和与NAD+结合相关的精氨酸和丝氨酸-苏氨酸-丝氨酸序列，它们共同参与ART活性。ART 通过水解 NAD，将一个或多个 ADP-核糖基团转移到受体蛋白上的特定氨基酸上，同时释放烟酰胺来催化蛋白质的翻译后修饰。这种修饰已被证明参与细胞内信号转导的调节、炎症因子的释放和细胞稳态的破坏，最终导致细胞凋亡等效应。缺乏 ART 活性的突变和/或截短的 CARDS TX 分子无法在体内激活 NLR 家族热蛋白结构域 3 (NLRP3) 炎症小体，表明 CARDS TX 的 ART 活性对于 NLRP3 炎症小体激活是必需的。此外，还发现用热灭活的 CARDS TX 处理的细胞没有显示出细胞内相应 ADP-核糖基化蛋白的证据。初次暴露后用额外的 CARDS TX 处理的细胞显示，先前形成的 ADP 核糖基化蛋白不再受后者的影响，这表明 CARDS TX 具有真正的 ART 活性。动物研究表明，将 rCARDS TX 暴露于狒狒气管环中会导致 24-48 小时内纤毛运动减慢或停止。在组织学水平上，可以看到病理变化，包括细胞肿胀、核碎裂、细胞质空泡化和细胞极性破坏。同样，用 CARDS TX 治疗小鼠会导致肺组织血管和气道周围炎症细胞浸润，并伴有呼吸道上皮细胞损伤，表现为特征性空泡化和细胞质变性。
3.2. CARDS TX 诱导的细胞质空泡化
哺乳动物细胞中的空泡化是病原体入侵后细胞内运输系统破坏引起的形态改变。研究发现 CARDS TX 通过细胞内囊泡运输以浓度依赖性方式诱导哺乳动物细胞中酸性液泡的形成。rCARDS TX 诱导的液泡起源于晚期内体区室，观察到其周围富含 Rab9、溶酶体相关膜蛋白 1 (LAMP1) 和溶酶体相关膜蛋白 2 (LAMP2) 的表达。Rab9 是一种主要与晚期内体相关的小 GTP 酶，介导 CARDS TX 的细胞内转运，rCARDS TX 诱导的液泡形成需要 Rab9 的参与。在 V-ATP 酶抑制剂巴弗洛霉素 A1 存在的情况下，在 rCARDS TX 诱导的空泡中检测到中性红摄取减少，表明 rCARDS TX 介导的空泡形成依赖于 V-ATP 酶的活性。此外，发现 rCARDS TX 诱导的液泡的酸性腔会影响毒素降解，但不影响其与宿主细胞的结合和/或进入宿主细胞。胞质空泡化可以是暂时的，也可以是不可逆的，而 CARDS TX 诱导的空泡化被认为是不可逆的变化。除了影响酸性细胞器外，不可逆空泡化还可以影响内质网、已知的内溶酶体系统中的非酸性细胞器和高尔基体。由于囊泡运输与细胞器的组成和特定的细胞功能有关，因此囊泡内容物可以参与蛋白质和脂质等大分子的降解和分解。这些功能的失调不可避免地会导致细胞器的各种破坏，包括诱导线粒体功能障碍、细胞运输的改变以及免疫反应、细胞凋亡和自噬的干扰。
3.3. NLRP3炎症小体激活
MP诱导炎症反应主要涉及四个途径，即脂蛋白识别、自噬、炎症体激活和细胞粘附。研究发现，CARDS TX 通过 NLRP3 的 ADP 核糖基化调节炎症小体活性并增强 IL-1β 分泌。NLRP3 是炎症小体的关键成分，对于 MP 感染期间炎症小体激活和 IL-1β 加工至关重要。NLRP3 炎症小体的“经典”激活途径由 Toll 样受体 (TLR) 和细胞因子受体（例如 TNF 受体或 IL-1 受体）触发，以响应来自病原体相关分子模式 (PAMP) 和损伤相关的信号。分子模式（DAMP）。这导致炎症小体的组装、caspase-1的激活、IL-1β原和IL-18原的裂解，以及活性促炎细胞因子的产生和释放。此外，CARDS TX还能增强炎症小体的激活，NLRP3炎症小体可能参与多种信号通路对细胞造成损伤。研究发现rCARDS TX可以通过TLR4途径诱导单核细胞中IL-23的表达。MP 感染后，观察到 CARDS TX 依赖 TLR2/CD14/MyD88 途径促进 HMGB1 的释放，HMGB1 是一种与 MPP 严重程度相关的炎症标记物，并参与与 MPP 发展相关的免疫过程。这些关于 CARDS TX 相关致病信号通路的研究为靶向治疗提供了额外的可能性。
3.4.炎症细胞浸润
对暴露于单剂量 rCARDS TX 的小鼠的支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的分析揭示了细胞组成和细胞因子谱的动态变化。有研究观察到接种 rCARDS TX 两天后，肺血管系统和肺泡周围空间的浸润以中性粒细胞为主，伴有少量淋巴细胞，到第 4 天和第 7 天，浸润细胞的比例已变为以淋巴细胞为主；细胞因子水平在暴露后第 2 天达到峰值，随后下降，与接受低剂量 rCARDS TX 治疗的小鼠相比，接受高剂量 rCARDS TX 治疗的小鼠表现出更强烈的炎症反应，主要是促炎性 Th1 型反应。相比之下，麦地那等人的报道中rCARDS TX 治疗诱导混合嗜酸性粒细胞-淋巴细胞炎症反应。他们的研究表明，暴露后第 4 天和第 7 天，BALF 中的主要细胞类型从中性粒细胞转变为嗜酸性粒细胞，并伴有淋巴细胞浸润。与对照组相比，实验组Th-2细胞因子IL-4和IL-13的表达量增加了30倍，而Th-2趋化因子CCL17和CCL22的表达量增加了70-80倍，与对照组一致。与过敏性疾病相关的强烈炎症反应。一些研究人员还分析了暴露于 rCARDS TX 的狒狒的气道炎症，表明其特征是显着的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，并表现出主要为 Th-2 型混合免疫反应。尽管 CARDS TX 促进细胞因子产生的机制尚不清楚，但这些研究证明了 CARDS TX 在 MP 引起的致病性炎症损伤中的重要作用，并提示其与过敏性疾病的潜在联系。
4. MP 感染和 MP 相关哮喘中的 CARDS TX
4.1.与 MP 感染的关系
MP感染可引起强烈的炎症反应和肺损伤，其特征是细胞因子和趋化因子的快速产生，并伴有淋巴细胞炎症。在用 CARDS TX 治疗的小鼠中，观察到炎症细胞浸润肺组织的血管和气道周围。此外，接触该毒素会导致小鼠出现持续气道阻塞 (AO) 和短暂性气道高反应性 (AHR) 长达 21 天。气道功能的这些变化可能是由于炎症反应增加所致。暴露于 rCARDS TX 的狒狒气管环显示出纤毛停滞、结构损伤、细胞肿胀、细胞质空泡化、核碎裂和溶解的证据，最终导致细胞死亡。rCARDS TX 诱导的组织病理学变化、炎症反应和气道改变与 MP 感染期间观察到的相似，表明 rCARDS TX 在 MPP 的致病机制中起着至关重要的作用。在进一步探索CARDS TX和MPP之间的关系时，研究人员发现在MP感染的小鼠感染后第35天，观察到肺组织中的支气管和血管周围仍然存在CARDS TX浸润，可能是由于 MP 的持续存在和持续的低水平毒素合成。气道重塑和功能损伤可能导致气道慢性炎症，导致肺部慢性损伤，这可能导致其他急慢性呼吸道疾病。在37例呼吸机相关肺炎疑似病例中，CARDS TX阳性率高达41%，其中CARDS TX阳性患者机械通气天数较长，平均氧饱和度较低。在通过鼻腔途径感染 MP 的小鼠中，BALF 中的 CARDS TX 水平与 MP 细胞负载和肺组织炎症程度相关，表明较高的 MP 数量与较高的水平与更严重的疾病相关，CARDS TX 在 MP 感染期间合成，与 MP 复制和持久性以及气道炎症和肺组织病理学密切相关。未来的研究应进一步探讨CARDS TX表达水平与MP感染疾病严重程度之间的关系。迄今为止，CARDS TX的研究主要集中在基础研究，希望未来能够纳入更多的临床数据进行分析。
4.2.与哮喘的关系
哮喘是一种慢性肺部疾病，其特征是气道炎症和气道反应性增强。已知多种因素会导致支气管哮喘的发生，而反复呼吸道感染被认为是重要的诱因。MP感染不仅会增加患哮喘的风险，还会加剧气道高反应性，加重病情，导致严重哮喘。一项队列研究表明，MP 阳性患者的哮喘总体发病率是非 MP 队列的 3.91 倍，且早发性哮喘（12 岁之前诊断）和晚发性哮喘的风险较高。MP 感染患者出现哮喘（12 岁或 12 岁以后诊断）。
MP 在哮喘发病机制中的作用仍存在争议。一些研究人员提出 CARDS TX 与哮喘的发生、恶化和控制不良之间存在联系。BALB/cJ 小鼠的研究表明，CARDS TX 可以增加卵清蛋白致敏小鼠中 IL-4 和 IL-13 的 mRNA 表达，同时加剧气道中的嗜酸性粒细胞炎症，并使现有的过敏性炎症恶化。暴露于 CARDS TX 和 MP 的动物在血管和气道周围表现出炎症细胞浸润。CARDS TX 诱导的“哮喘样”组织病理学变化类似于在过敏性疾病中观察到的变化，其特征是嗜酸性粒细胞水平增加、辅助 T 2 (Th2) 细胞反应、趋化因子表达升高、粘液产生和气道阻力增加。粘膜接触 CARDS TX 的小鼠表现出总 IgE 和 CARDS TX 特异性 IgE 水平增加。此外，全长CARDS TX和N端肽序列均诱导肥大细胞脱粒，肥大细胞-IgE轴是过敏性炎症的核心。这些研究结果表明 CARDS TX 可能引发哮喘的发生。
此外，据报道，42% 的慢性持续性哮喘成人患者为 CARDS TX 阳性，而健康对照组中这一比例仅为 1% 。患有难以治疗的哮喘且在呼吸道分泌物中检测到 CARDS TX 的儿童被发现比 CARDS TX 阴性儿童的生活质量和疾病控制更差，表明毒素加重了疾病。这些数据表明 CARDS TX 是 MP 相关哮喘的致病因素。CARDS TX通过其ART活性激活NLRP3炎症反应，引发一系列炎症反应。另一方面，毒素引起的水泡形成会减慢纤毛运动并破坏呼吸道上皮的完整性，这两者都与喘息的发生、恶化和持续密切相关。然而，CARDS TX与哮喘之间的具体关系还需要进一步研究。
5. 针对CARDS TX的疫苗前景
一项对大环内酯类耐药肺炎支原体 (MRMP) 感染全球趋势的荟萃分析显示，其患病率不断上升，东南亚在受影响地区排名第二。随着耐药率和疾病严重程度的持续上升，研究人员正在积极寻求有效的预防措施，其中疫苗接种成为一项重要策略。然而，使用灭活 MP 接种的疫苗未能有效提供实质性保护。结果发现，接种含有灭活MP和明矾的疫苗的小鼠与对照组相比，BALF中炎症细胞的数量没有显着差异。此外，疫苗诱导的 MP 特异性抗体增加了体内炎症水平。疫苗接种后临床症状的恶化被称为疫苗增强性疾病（VED）。
对CARDS TX特异性抗体水平的分析显示，感染后第7天，75%的病例中检测到抗CARDS TX IgM抗体，达到峰值。随后 IgM 水平在第 35 天下降至最低点，而 IgG 水平在第 7 天至 35 天之间逐渐上升。对 CARDS TX 及其片段的血清学反应的进一步研究表明，纯化的全长 CARDS 毒素及其 N 端和 C 端区域均表现出优异的特异性和敏感性。尤其是 C 末端区域，表现出很强的免疫原性。暴露于 rCARDS TX 和 MP 的狒狒表现出不同的血清反应。与感染MP相比，感染rCARDS TX的狒狒表现出特异性IgM和IgG抗体的显着增加，表明CARDS TX的疫苗开发潜力。为了评估 rCARDS TX 作为小鼠疫苗抗原的效果，研究人员使用 c-di-GMP 作为佐剂，并通过鼻内应用施用 rCARDS TX。MP 攻击一天后，与磷酸盐缓冲盐水治疗的小鼠相比，rCARDS TX 免疫小鼠的 BALF 中 MP 数量、LDH 水平、中性粒细胞和炎症细胞因子显着减少。这些结果表明，使用rCARDS TX作为疫苗抗原可以减少MP感染和MP诱导的炎症反应。然而，目前尚无可用于人类鼻内注射疫苗的佐剂，因此需要进一步研究来评估 rCARDS TX 作为疫苗抗原的潜力。
六、挑战与前景
在宿主细胞感染过程中，MP 的紧密接触和持续的生化功能对于破坏组织完整性并引起细胞毒性至关重要。例如，在早期MP粘附和细胞释放外毒素后，细胞质液泡逐渐融合，导致细胞质扭曲，从而导致广泛的细胞破裂和脱落。然而，在MP的发病机制中，MP感染的临床过程主要被认为是由宿主免疫和炎症反应。相比之下，支原体细胞成分引起的直接细胞病理学效应似乎不太显着。外毒素可能仅限于初始感染或当宿主反应试图清除感染时持续存在的能力。而且，这种毒素的蛋白质结构模式与细菌AB毒素相似。AB毒素根据其结构和功能命名，由两部分组成：具有酶活性的A成分和与靶细胞结合的B成分。这两个组分通过二硫键连接，可以被酶裂解。除了在不同MP菌株中检测到CARDS TX之外，在支原体属内的其他微生物中也发现了与CARDS TX类似的ART活性。
据报道，呼吸道病原体，例如白喉杆菌和百日咳博德特氏菌，会产生对其各自疾病机制至关重要的 ADP 核糖基化毒素。在免疫接种中使用白喉毒素（灭活的 ADP-核糖基化白喉毒素）来控制临床白喉已证明该毒素在疾病发病机制中的重要作用。在感染 MP 的小鼠中也观察到了 CARDS TX 特异性抗体的显着血清转化。针对 CARDS TX 的抗体滴度至少与针对“免疫显性”肺炎支原体粘附素 P1 的抗体滴度相当，表明 CARDS TX 可以单独使用或与 P1 联合用于诊断和疫苗接种。MP的早期诊断比较困难，目前用于检测MP的实验室方法包括聚合酶链反应和血清学检测。尽管 CARDS TX 被认为对 MP 具有良好的特异性和敏感性，但目前尚无在诊断中使用 CARDS TX 的先例。CARDS TX 在 MP 相关疾病中的作用仍需探索。
CARDS TX的发现为MP引起的炎症损伤和病理变化的研究提供了新的方向。进一步研究CARDS TX在MP感染中的作用，并探索其与免疫细胞、炎症反应和组织病理学变化的关系，将为MP感染和哮喘相关疾病的潜在分子机制提供更多线索。此外，CARDS TX疫苗的开发有望为MP感染的预防提供新的策略，未来的研究可重点关注CARDS TX疫苗候选抗原的筛选和鉴定、佐剂的研究以及疫苗的临床试验。疫苗的安全性和有效性。综上所述，随着对CARDS TX研究的不断增多，有理由相信这种重要的毒素将在MP感染引起的疾病领域发挥重要作用。还希望找到预防和治疗 CARDS TX 相关疾病的新方法，以改善 MP 感染患者的预后和生活质量。
