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有小伙伴问：巨噬细胞方向的课题除了做极化还能做啥？今天大麦带来的这篇文章手把手教你用“巨噬细胞吞噬”联合“多组学”设计一篇国自然！
南方医科大学团队从脓毒症与肠道微生物群落破坏之间的关联入手，旨在深入理解肠道微生物在脓毒症中的作用。研究通过一系列实验，包括RNA测序、代谢组学、单细胞测序、分子对接、体内外实验等，发现鼠李糖通过直接激活SLC12A4来促进巨噬细胞的吞噬作用。此外，研究还设计了临床验证，利用脓毒症患者的临床样本，验证鼠李糖对人类巨噬细胞吞噬能力的影响，增强了临床相关性。整体设计从宏观动物模型到微观分子机制，再到临床样本验证，形成了一个从整体到局部再到整体的研究闭环，是一篇非常标准的国自然设计模版，千万不要错过哦~
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题目：肠道共生代谢物鼠李糖通过激活SLC12A4促进巨噬细胞吞噬，保护小鼠免于脓毒症 杂志：Acta Pharmaceutica Sinica B肠道菌群被认为是脓毒症发展的关键上游调节因子之一。传统上，脓毒症被认为会破坏肠道屏障功能，反过来，肠道细菌可能会进入循环系统，促进全身炎症反应。巨噬细胞作为先天免疫的主要细胞类型，其功能可受肠道共生体的多种代谢物调节，进而影响脓毒症的易感。然而，肠道共生菌群如何参与脓毒症的发展仍然是未知的。因此，确定直接影响脓毒症的特定微生物产物对于开发败血症患者的新治疗方法至关重要。1）通过使用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立多微生物脓毒症小鼠模型。2）利用抗生素处理小鼠，分析肠道微生物群落的变化，并通过代谢组学确定与脓毒症相关的代谢物变化。4）鼠李糖通过直接激活SLC12A4促进巨噬细胞的吞噬作用的分子机制探索。5）利用脓毒症患者的临床样本，验证鼠李糖对人类巨噬细胞吞噬能力的影。通过评估抗生素（ABX）鸡尾酒预处理小鼠对CLP（盲肠结扎穿孔）的反应，作者初步研究了肠道微生物对多微生物脓毒症的贡献。ABX预处理显著降低了CLP术后小鼠的存活率，加重了肺部病理变。根据血浆丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和肌酐（Cr）水平的生化分析证实， ABX预处理小鼠器官损伤更严重。这些研究表明共生微生物对特定病原体感染具有保护作用。 接下来，评估CLP后的全身炎症，以探讨肠道微生物群对脓毒症进展的影响。腹腔灌洗液（PLF）细胞的RNA-seq结果显示，CLP组和CLP+ABX 组表达谱存在显著差异，富集了许多炎症相关通路。在 CLP + ABX 小鼠中检测到 PLF 细胞中关键细胞因子和趋化因子基因水平升高。结果表明，小鼠肠道微生物群耗竭后，脓毒症诱发的免疫异常明显增加。接下来，通过对 ABX 处理过和未处理过的动物粪便进行 16S rDNA 测序和代谢组学分析，探索共生微生物群如何抵御脓毒症。ABX显著降低了微生物多样性，改变了微生物代谢谱，显著消除了肠道中存在的几种代谢物。 经 ABX 预处理的小鼠血浆和粪便中原核生物衍生的鼠李糖水平显著下降。在 CLP 模型中，ABX 预处理组鼠李糖的浓度也远低于无 ABX 预处理组。在 ABX 预处理的脓毒症小鼠体内补充鼠李糖可显著提高存活率。多种器官损伤测试都支持鼠李糖的保护作用。另一种临床前脓毒症模型也证实了上述发现。总之，数据证明鼠李糖是提高宿主对脓毒症防御能力的关键反应性生物活性代谢物之一。 为了进一步研究鼠李糖对脓毒症进展的调节作用，作者对外周血单核细胞（PBMCs）进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。分为三组：对照组（CLP）、清除肠道微生物群后（CLP + ABX）和鼠李糖处理组（CLP + ABX + Rha）作者从三组脓毒症小鼠（n = 3 只/组），测序了83,525 个细胞。聚类分析确定了 6 个不同的细胞群。 对不同组间差异基因进行KEGG通路富集分析，结果表明，脓毒症小鼠肠道微生物群耗竭后，细菌负荷可能会增加。鼠李糖可通过调节吞噬作用和减少细菌负荷来保护宿主免受脓毒症的侵害。为了进一步验证这些测序数据，作者采用了大肠杆菌诱导的腹膜炎和CLP诱导的脓毒症模型，收集血液和腹腔灌洗液（PLF）评估小鼠体内的细菌量。腹膜炎模型中，对照组从腹腔灌洗液中培养出的菌落数远远少于 ABX 预处理组。接下来，作者研究了鼠李糖是否会影响大肠杆菌感染小鼠的细菌负荷，发现鼠李糖处理过的小鼠比对照组小鼠的菌落数少。巨噬细胞是感染后参与清除细菌的关键细胞类型，作者根据单细胞测序数据对巨噬细胞进行分组和分析，以探索鼠李糖与巨噬细胞之间的功能关联。基因集变异分析（GSVA）显示，ABX 处理后，Fcγ R 介导的吞噬通路明显下调，而补充鼠李糖后则得到了挽救。流式细胞仪、平板菌落形成检测和共聚焦显微镜结果表明，鼠骨髓巨噬细胞（BMDMs）和人类白血病单核细胞系（THP-1）巨噬细胞在与大肠杆菌培养 45 分钟后，其吞噬能力和细菌清除率均高于对照组。这些数据表明，鼠李糖在脓毒症进展期间的有益作用与吞噬功能的改善有关。 为了探索鼠李糖作用的内在机制，作者合成了一种生物素化鼠李糖（Bio-Rha）并测定了它的生物效应。亚细胞定位表明细胞表面存在鼠李糖结合蛋白。接下来，利用蛋白质组芯片鉴定潜在的鼠李糖结合蛋白。并通过分子对接和细胞转染实验，证实了巨噬细胞中的 SLC12A4 是鼠李糖的靶标。接下来，通过在巨噬细胞中使用SLC12A4过表达质粒和siRNA评估 SLC12A4如何参与巨噬细胞的细菌吞噬。结果显示SLC12A4过表达显著增强了BMDMs的吞噬活性和细菌杀伤力， siRNA则结果相反。在THP-1衍生巨噬细胞中也展示的类似的结果，表明巨噬细胞的吞噬功能需要 SLC12A4。 接下来研究了鼠李糖在Slc12a4 siRNA 处理的情况下对吞噬功能的影响。结果显示，鼠李糖能促进细菌的吞噬和清除，但对Slc12a4 沉默的 BMDMs 和 THP-1 衍生巨噬细胞的影响很小。以上数据证明了 SLC12A4 在巨噬细胞介导的鼠李糖吞噬和细菌清除中发挥了关键作用。鼠李糖通过调节Rac1和Cdc42活性增强吞噬作用为了进一步了解鼠李糖介导的吞噬调节机制，作者接下来确定了受鼠李糖影响的蛋白质。通过分析参与吞噬通路的基因，发现 Rho 家族 GTPases、Cdc42 和 Rac1 在 CLP + ABX 组中下调，而补充 Rha 则能挽救其丰度。与无 ABX 预处理的小鼠相比，ABX 处理可显著降低 CLP 模型中 GTP-Cdc42 和 GTP-Rac1 的水平，补充鼠李糖可挽救这些 Rho GTPases 的水平。在大肠杆菌感染过程中，鼠李糖补充组的 BMDMs 和 THP-1 衍生巨噬细胞中活化的 Cdc42 和 Rac1 表达均明显高于对照组。接下来评估 SLC12A4 在鼠李糖介导的 Cdc42 和 Rac1 活性调节中的作用。在 SLC12A4 敲除组中，Cdc42 和 Rac1 的活化都明显降低，表明 SLC12A4 在调节巨噬细胞中 Rac1 和 Cdc42 的活化中起着关键作用。 鼠李糖增强人血液单核细胞源性巨噬细胞的细菌吞噬作用为了评估鼠李糖是否在人血液单核细胞源性巨噬细胞（MDMs）中存在类似的增强细菌吞噬功能，从健康志愿者和脓毒症患者中分离并培养MDMs。鼠李糖显著增强了健康志愿者和脓毒症患者MDMs的吞噬和细菌清除能力。因此，鼠李糖可能作为一种促进脓毒症细菌吞噬的新型治疗剂。 这篇文章通过结合动物模型、分子生物学、细胞生物学和临床样本分析，提供了肠道微生物代谢物在脓毒症中作用的新视角，并为未来的治疗提供了新的靶点。这篇文章搭载科研热点加之思路清晰实验严谨，高分文章轻松拿捏！心动的宝子快来滴滴大麦吧！成熟的发文思路和生信分析方法，助力你拿捏2025国自然！推荐阅读
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