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这篇文章来自暨南大学第一附属医院，首先作者利用scRNA-seq技术分析了糖尿病骨关节炎（DOA）滑膜细胞组成，锁定了巨噬细胞和糖酵解。接下来通过机制研究发现YAP1/TXNIP信号轴的关键作用。随后，作者开发了一种新型的纳米颗粒药物递送系统（MVPs），并通过动物实验证实了该纳米颗粒的作用。整个研究层层递进，让人眼前一亮。
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题目：靶向YAP1调控的纤维母细胞样滑膜细胞糖酵解损伤巨噬细胞浸润以改善糖尿病骨关节炎进展
杂志：Advanced Science
发表时间：2024.2
研究背景
免疫细胞/巨噬细胞与成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）之间的相互作用在引发滑膜炎中起关键作用；然而，它们与代谢紊乱，包括糖尿病性骨关节炎（DOA）的关系在很大程度上是未知的。
研究思路
研究结果
scRNA‐Seq揭示了DOA滑膜中M1‐巨噬细胞的富集
scRNA‐seq研究使用了来自不同情况患者的滑膜标本，包括半月板或前交叉韧带（ACL）损伤患者（3例，损伤后2-4周，代表正常滑膜），OA（骨关节炎）患者（2例）和DOA患者（3例），他们接受了关节镜检查或全膝关节置换术（OA和DOA）手术。
通过结合正常组、OA组和DOA组的数据，能够识别出8个不同的细胞簇，包括滑膜下层（Syn_subL） FLSs、滑膜衬里（Syn_L） FLSs、ECs、周细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞和肥大细胞，总计83097个细胞。与OA患者（16.7%）和正常滑膜患者（13.9%）相比，DOA患者滑膜中巨噬细胞的比例（44.9%）明显更高。接下来，作者探索了巨噬细胞的特定亚群，巨噬细胞可以进一步分为两个亚簇：C0和C1。与正常滑膜患者（6.9%和5.4%）相比，DOA患者滑膜中C0和C1的相对比例（21.0%和18.0%）显著升高。基因集变异分析（GSVA）和基因集富集分析（GSEA）进一步表明，与正常滑膜中的巨噬细胞相比，DOA巨噬细胞表现出与细胞粘附、免疫细胞激活和细胞因子产生相关的信号通路的富集。
此外，利用M1极化巨噬细胞的典型标记物，进行免疫组化（IHC）染色来验证活化巨噬细胞的富集。结果提示，DOA滑膜中M1巨噬细胞的富集可能是滑膜炎加重和DOA表型表现的原因。
FLSs中增强的TXNIP/GLUT1依赖性糖酵解有利于巨噬细胞的募集和浸润
作者发现与OA和正常滑膜相比，DOA患者的FLSs中巨噬细胞激活伴随着糖酵解代谢的增强。为了支持这一点，几个糖酵解基因，包括TXNIP， SLC2A1 (GLUT1), SLC2A5, HK1, PFKM (PFK1), FBP1， GAPDH, ENO1， PKM和LDHA在DOA滑膜FLSs中都发生了改变。此外，与OA患者相比，DOA患者滑膜中TXNIP的表达下调。接下来，研究DOA环境诱导的慢性低度炎症是否会影响TXNIP的mRNA表达以及随后体外FLSs的糖酵解代谢。正如预期，IL‐1β处理显著抑制了FLSs中TXNIP mRNA的表达。此外，发现IL‐1β显著增加与糖酵解相关的细胞外酸化率（ECAR）和FLSs的糖酵解能力。接下来，在不同葡萄糖水平的炎症刺激下培养FLSs，结果显示，高糖和IL - 1β的联合可以进一步增强FLSs的糖酵解，表明代谢变化可与细胞因子信号相互作用，导致DOA关节炎症。
对scRNA - seq数据的GO分析确实显示了DOA滑膜中炎症信号的增加（图2G）。一致地，IL‐1β对TXNIP的抑制不仅导致糖酵解活性增加，而且促进了一系列炎症介质的表达，包括ICAM‐1、CCL2、MMP13和MMP1。此外，IL-1β或TNF - α单独或与高剂量葡萄糖联合激活FLSs或软骨细胞（CHON），诱导ICAM - 1和VCAM - 1表达，从而促进THP1细胞与活化细胞的粘附。相反，用葡萄糖类似物2‐脱氧‐D‐葡萄糖（2‐DG）抑制糖酵解可显著降低ICAM‐1 mRNA和蛋白的表达，随后导致巨噬细胞迁移减少。接下来，通过共培养模型研究了滑膜细胞糖酵解的增加是否可以调节巨噬细胞的极化。值得注意的是，用2 - DG抑制IL - 1β刺激的FLSs糖酵解可通过旁分泌方式抑制phorbol 12 -肉豆汁酸13 -醋酸酯（PMA）诱导的THP - 1分化巨噬细胞中CD86 mRNA的表达。这些结果表明，滑膜细胞中糖酵解的增强支持能量的产生，并为细胞因子的产生提供糖酵解的中间体，从而介导DOA关节内巨噬细胞的募集和激活。
YAP1过表达通过增强DOA滑膜糖酵解驱动M1巨噬细胞浸润
作者发现YAP1及其上下游分子的表达在一系列细胞中发生了改变，包括巨噬细胞、滑膜细胞、周细胞和内皮细胞。免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）染色一致证实，相对于OA患者，DOA患者的滑膜中YAP1过表达。接受DMM手术的db/db小鼠与对照小鼠相比获得了类似的结果。鉴于上述数据表明，高糖联合IL - 1β促进了FLSs的糖酵解，YAP1是否能调节FLSs的代谢尚不明确。与ICAM‐1的表达模式类似，IL‐1β单独或与不同浓度的葡萄糖联合刺激FLSs或CHON，剂量依赖性地增加了YAP1的表达。用Verteporfin（Vt）抑制YAP1可以减轻IL‐1β‐诱导的fls中TXNIP的抑制。因此，Vt显著降低了由不同浓度的葡萄糖和IL - 1β引发的FLSs的糖酵解，这模拟了体外糖尿病环境。
另一方面，作者还评估了ICAM‐1表达对YAP1抑制的响应。YAP1阻断与Vt剂量依赖性降低IL - 1β -诱导的ICAM - 1表达。敲除YAP1也降低了IL‐1β或TNF‐α加高糖刺激激活的FLSs和CHON中的ICAM‐1的表达。此外，在IL‐1β存在的情况下，体外用Vt处理FLSs时，巨噬细胞的迁移受到损害。作者随后研究了YAP1是否可以通过共培养系统协调巨噬细胞极化来调节滑膜炎症。经IL‐1β处理的FLSs提高了THP‐1分化的巨噬细胞中CD86 mRNA的表达，而经Vt处理后CD86 mRNA的表达被抑制，这表明YAP1通过旁分泌方式调节FLSs与巨噬细胞的相互作用。此外，Vt直接抑制THP1来源的M1巨噬细胞中CD86的mRNA表达。同样，Vt抑制YAP1可显著降低RAW264.7细胞中M1巨噬细胞的极化。这些结果表明，YAP1是滑膜糖酵解的关键驱动因素，靶向YAP1可以减轻糖酵解，从而减弱巨噬细胞的募集和极化。
负载YAP1抑制剂的M1膜包覆纳米颗粒（MVP）的特性
接下来，作者旨在利用巨噬细胞膜伪装纳米颗粒来提高Vt的靶向特异性，从而提高组织保留和药物递送效率。纳米颗粒核心由Vt加载的PLGA纳米颗粒（VPs）组成，这些纳米颗粒是通过纳米沉淀法制备的。
MVP的滑膜细胞摄取、关节保留和分布
为了评估MVPs治疗DOA的疗效，以1,1‐二十八烷基‐3,3,3,3‐四甲基吲哚三碳氰碘化物（DiR）作为体内不同时间点的指标，分析了MVPs在膝关节中的保留情况和生物分布。DiR - Vt显著降低了3天，而MVP增强了关节潴留长达9天，表明MVP优于单独使用Vt。为了进一步评估MVP在滑膜中的靶向特异性，作者建立了前交叉韧带横断（ACLT）诱导的OA，持续6天，然后每三天注射一次DiD标记的MVP。ACLT在db/db小鼠中诱导了第6天的滑膜增生，血小板衍生生长因子受体α (PDGFR α)染色的FLSs和iNOS染色的巨噬细胞分别显著增加。虽然MVPs被指定为M1巨噬细胞摄取，但作者观察到DiD标记的MVPs在增生性滑膜中富集，与iNOS+和PDGFR α+滑膜细胞共定位，这表明MVPs可能被滑膜中的两种主要细胞类型（FLSs和巨噬细胞）摄取。值得注意的是，MVPs的摄取可以通过抑制PDGFR - α和iNOS染色细胞来抑制滑膜增生（图5H）。这些结果表明，装载YAP1抑制剂的M1膜包被纳米颗粒是一种有希望的双重靶向FLSs和M1巨噬细胞治疗关节疾病的策略。
MVP减轻OA疼痛和关节破坏
接下来，通过ACLT手术在10周龄db/db小鼠中建立更严重的DOA模型，然后进行一系列治疗，评估mvp在DOA中的功能作用。基于von Frey实验、实验动物行为观察登记和分析系统以及rotarod实验，关节内给药mvp有效地减轻了ACLT诱导的DOA关节疼痛。此外，通过小动物MRI， mvp可以显著减少DOA小鼠的关节炎症和软骨退变。HE和Safranin O染色进一步证实，ACLT糖尿病小鼠诱导滑膜增生、软骨损伤、表面纤维化和蛋白多糖丢失，在ACLT膝关节关节内注射mvp可大大减轻OA表型，保留软骨并降低滑膜炎评分。与这一发现一致，mvp治疗能够减少MMP13染色的细胞，表明通过抑制MMP13活性来阻止OA进展的有效性。
为了了解scRNA - seq数据中观察到的MVPs治疗作用的潜在机制，作者对M1巨噬细胞生物标志物（CD86和iNOS）进行了IHC和IF染色。MVPs显著降低DOA小鼠滑膜中iNOS -和CD86 -染色的M1巨噬细胞的百分比。接下来，作者探讨了mvp对体内糖酵解代谢的调节。与糖酵解水平与M1巨噬细胞极化正相关的观察结果一致，GLUT1（葡萄糖代谢的主要限速葡萄糖转运蛋白，受TXNIP负调控）的滑膜表达在MVPs治疗后降低。通过IF， TXNIP与滑膜标志物PDGFR α共定位表达增加。此外，mvp显著减弱了DOA小鼠滑膜中YAP1调控的ICAM - 1表达。综上所述，这些结果表明，MVPs介导的YAP1靶向是一种有希望的DOA治疗方法，主要通过抑制FLSs糖酵解和M1巨噬细胞浸润。
文章小结
这篇文章通过结合细胞生物学、分子生物学和纳米技术，为DOA的病理机制理解提供了新的视角。国自然热点加持的研究思路和多维度的研究方法给大家提供了高分文章的范例！如果你也想有耀眼的成果，但暂时缺乏大胆创新的研究思路，那就来咨询大麦吧，这里有超多适合你的高分思路哦！
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