临床医生发文捷径！单细胞“干湿结合”，省时省力又省钱！南京医科大学携手线粒体自噬+泛素化，发文效果立竿见影！

文摘 2024-11-09 10:00 上海

Hey!朋友们，大麦继续准时来报道啦！

“干湿结合”目前可是个香饽饽~搞的生信的可以做，搞实验的也离不开它，毫不夸张的说它目前可是高分文章的标配。大麦今天就从一篇单细胞干湿结合的文章为大家说道说道~

大家都知道单细胞测序价格昂贵，目前10X价格仍需1万1个样本，仅有部分大课题组才能一次性测序几百例样本，那没钱测序的你该如何开展后续课题呢？答案是结合公共免费数据库单细胞数据挖掘先打好前期研究基础，增加文章分析量+工作量+研究深度，给文章增色，提高创新新和投稿命中率。

大麦今天分享的就是南京医科大学谭若芸、顾敏等团队发表的一篇单细胞公共数据库分析+湿实验的高质量文章，该研究从分子、细胞到整体动物水平，全面地探究了Rictor/mTORC2信号通路在肾移植后纤维化中的作用机制，单细胞分析＋实验验证，可操作性强，成本低，项目周期短，真的是适合临床医生入手的高性价比文章！还可以为后续申请国自然基金奠定研究基础。此外，想中标国自然的朋友注意了，一个有意义的课题方向是关键，其次新颖的方案和思路，最后结合干实验生信分析打好前期研究基础，三者结合才能无敌向前冲，恰好这三点大麦都能胜任！需要帮助的朋友速来滴滴我吧~

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题目：Rictor/mTORC2信号通过调节BNIP3介导的线粒体自噬促进肾血管内皮向间质转化和肾同种异体移植物间质纤维化

发表时间：2024年5月

研究背景

慢性同种异体移植功能障碍（CAD）是肾脏移植患者的主要问题，其特征是肾间质纤维化和肾小管萎缩（IF/TA）。肾血管内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）是导致IF/TA的重要因素，但其具体机制目前尚不明确。本研究通过单细胞分析发现Rictor可能是调节EndMT的关键分子，并探讨了Rictor/mTORC2信号通路在肾移植间质纤维化中的作用及其通过BNIP3介导的线粒体自噬的潜在机制。

研究思路

研究主要结果

1.通过单细胞转录组分析揭示了CAD患者同种异体肾血管内皮细胞中Rictor的上调

通过分析GSE195718和GSE131882单细胞公共数据集，发现在CAD患者的肾移植组织中，Rictor在肾血管内皮细胞中的表达显著上调；对DEGs进行GO和KEGG分析揭示了与EndMT相关的生物学过程和信号通路，如细胞黏附、细胞骨架组织、细胞-细胞黏附等；拟时序分析观察到Rictor在从正常移植组织到纤维化移植组织的轨迹中表达量显著增加，表明Rictor在EndMT的发展中可能起到重要作用。

2.Rictor/mTORC2信号在CAD患者和小鼠的肾血管内皮细胞中上调

在CAD组和肾移植小鼠模型（Allo组）的肾组织中，Rictor/mTORC2信号通路的组分表达水平上升，表明该信号通路被激活；肾血管内皮细胞标志物CD31的表达下降，而间充质细胞标志物FN（纤维连接蛋白）和α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）的表达上升，说明发生了EndMT。

HE和Masson染色显示，Allo组小鼠的移植肾脏组织中出现了显著的间质炎症细胞浸润、肾小球硬化和间质纤维化；免疫组化（IHC）和间接免疫荧光（IF）分析发现，Rictor在Allo组的肾血管内皮细胞中的表达增加。

在CAD组和Allo组中，炎症因子TNFα的表达上升，这与EndMT和Rictor/mTORC2信号通路的激活相一致，提示TNFα可能在EndMT的发生中起到了促进作用；在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中敲低Rictor的表达，并用TNFα处理，发现Rictor的沉默可以减轻TNFα诱导的EndMT，而Rictor的过表达则加剧了这一过程。

3.Rictor基因敲除可增强HUVECs中BNIP3介导的线粒体自噬

在Rictor基因敲除的HUVECs中，观察到线粒体自噬标志物如LC3-II表达的增加，以及线粒体蛋白VDAC1和TIMM233表达的下降，表明Rictor基因敲除可以激活线粒体自噬。通过免疫荧光（IF）和透射电子显微镜（TEM）分析，发现Rictor基因敲除的HUVECs中线粒体自噬体（mitophagosomes）的形成增加，提供了线粒体自噬激活的形态学证据。

在Rictor基因敲除的HUVECs中，BNIP3蛋白的表达显著上调，而其他线粒体自噬相关蛋白如PINK1、NIX和FUNDC1的表达没有显著变化，表明BNIP3是Rictor影响线粒体自噬的关键分子。Rictor基因敲除减轻了TNFα诱导的EndMT，表现为内皮细胞标志物CD31表达的恢复和间充质细胞标志物FN和αSMA表达的下降。

4.Rictor/mTORC2信号通路可通过K48连接的泛素化促进K130处BNIP3的蛋白酶体依赖性降解

Rictor基因敲除（KO）导致BNIP3蛋白的半衰期延长，表明Rictor可能通过影响BNIP3的蛋白稳定性来调节线粒体自噬。使用蛋白酶体抑制剂MG132可以阻止Rictor基因敲除引起的BNIP3蛋白水平上升，而自噬抑制剂CQ没有这种效果，说明Rictor通过蛋白酶体途径调节BNIP3的降解。

Rictor基因敲除减少了BNIP3的K48链接的泛素化，而K63链接的泛素化不受影响，说明Rictor通过促进K48链接的泛素化链的形成来调节BNIP3的蛋白酶体降解。通过点突变分析，发现BNIP3蛋白的K130位点是Rictor介导的泛素化的关键位点。Rictor过表达促进了BNIP3在K130位点的K48链接的泛素化，导致BNIP3蛋白水平下降。

5.MARCH5是特异性调控Rictor/mTORC2信号通路介导的BNIP3蛋白酶体依赖性降解的E3泛素连接酶

通过UbiBrowser平台预测和后续实验验证，确定MARCH5是与BNIP3相互作用的E3泛素连接酶，且在Rictor基因敲除的情况下MARCH5的表达下调，进而减少了BNIP3的泛素化水平。反之，Rictor过表达则通过增加MARCH5的活性，促进了BNIP3的泛素化。揭示了Rictor/mTORC2信号通路通过MARCH5调节BNIP3蛋白稳定性的机制。

MARCH5的敲低（siRNA介导的沉默）延长了BNIP3蛋白的半衰期，而MARCH5的过表达则加速了BNIP3的降解，表明MARCH5在调节BNIP3蛋白稳定性中起关键作用。使用蛋白酶体抑制剂MG132可以阻止MARCH5介导的BNIP3蛋白降解，而自噬抑制剂CQ没有这种效果，表明MARCH5通过蛋白酶体途径调节BNIP3的降解。通过点突变分析，发现BNIP3蛋白的K130位点是MARCH5介导泛素化的关键位点。

文章小结

该研究通过深入研究Rictor/mTORC2信号通路在肾移植纤维化中的作用机制，不仅增进了对肾移植纤维化病理过程的理解，也为开发新的治疗策略提供了重要的分子靶点和理论基础。通过分析公共数据库的单细胞转录组数据（干实验）引出课题，然后用湿实验逐步验证让结论变得solid，看来单细胞干湿结合才是绝配！省钱省力，动动手指，足不出户就能收集样本数据，结合国自然热点，稍加分析，一篇5-10 SCI就能到手！心动不如行动，想要单细胞课题设计评估或者生信分析的朋友们，点个关注速速联系噢！

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