慢性乙型肝炎病毒感染(CHB)影响超过2.57亿人，目前可用的抗病毒疗法可以抑制病毒复制，但由于cccDNA的持续存在，因此无法彻底清除。由于在实现CHB患者的完全治愈和清除病毒感染方面存在挑战，因此病毒表面抗原(HBsAg)的清除被认为是临床上期望的治疗终点，这也称为功能性治愈(FC)。近期有研究探索了持续控制HBsAg消失的机制基础，描述了CHB患者（包括无反应者和实现FC的患者）的肝内环境和匹配的外周血单核细胞(PBMC)的单细胞景观，医脉通特此摘译，以供临床医生参考。
一、研究方法
研究获取了29名CHB患者的配对血液和活检样本，其中包含9名达到FC的患者。使用肝活检从每位患者身上获取两份活检样本，并在同一时间点与匹配的PBMCs一起进行scRNA-seq和多参数流式细胞术分析。将单细胞转录组学（单细胞RNA测序）与基于多参数流式细胞术的免疫表型分析和多重免疫荧光相结合，以阐明与CHB与FC相关的免疫病理学细胞状态。
二、研究结果
1.CHB和FC的肝脏和匹配的PBMC单细胞图谱
FC队列中，大多数患者显示持续存在抗HBs抗体（图1A）。在FC患者的肝脏和匹配的PBMC中观察到适应性免疫细胞和先天免疫细胞组成的明显变化。CHB和FC患者的单细胞转录组分析捕获了肝脏内的47,109个细胞，包含26种不同的主要细胞类型/状态，对广泛细胞类型的初步分析显示，与CHB相比，FC患者肝内环境中T细胞明显减少，同时NK细胞和中性粒细胞增加（图1D）。在分析匹配患者的PBMCs时，未能观察到外周循环中的相同趋势（图1G）。多参数流式细胞术（图1H）也证实了FC患者肝活检中T细胞减少、NK/NKT群体增加，而外周循环未能捕捉到类似的变化（图1I）。总体而言，这些观察结果表明FC患者肝脏内免疫细胞组成可能存在特定变化，而这些变化可能并不总是准确反映在PBMCs中。
图1 CHB患者与FC患者分离的肝脏和匹配的PBMC的单细胞转录组图谱
2. FC患者表现出耗竭的CD8T细胞明显减少，并出现CD4相关适应性免疫反应
使用来自scRNA-seq数据中的簇特异性差异表达基因对亚簇T细胞和NK细胞进行深度表型分析（图2A、A'），结果识别出了不同的细胞亚型或细胞状态，FC患者中耗竭的PDCD1+CD8T细胞明显减少，而FOXP3+Treg几乎完全消失（图2A-D）。FC患者的TIGIT、LAG3和PDCD1等耗竭标志物显著降低（图2C、D）。
与CHB患者相比，FC患者的FOXP3+Treg频率的下降在肝脏中更为明显（图2C）。流式细胞术分析进一步证实了这些发现（图1H、I）。对肝脏中整体CD8T细胞进行体外直接流式细胞术分析也表明，FC患者中PD1+和TIM3+耗竭CD8T细胞的频率明显较低（图2E)。这不仅在CD69+组织驻留CD8T细胞中明显，在移行CD69-T细胞中也明显。根据qHBsAg水平对CHB患者进行分层表明，耗竭的CD8T细胞的减少与qHBsAg的减少相关（图2E）。
图2 FC患者表现出衰竭标志物的消失、先天免疫反应的增加和适应性免疫反应的改变
3.FC患者肝内NK细胞处于活跃状态
除了CD4-CTL的增加之外，FC患者的经典先天免疫反应也增强。肝脏scRNA-seq数据分析显示LR-NK细胞(CXCR6、EOMES)明显增加(图3A、A')，这些细胞被认为通过分泌细胞因子和与各种细胞类型的信号相互作用发挥更多的免疫调节作用，例如募集树突状细胞到炎症部位和促进抗原交叉呈递以重塑肝脏环境。如图3B、C所示，基因表达特征的通路分析强烈表明两种细胞类型的免疫效应功能增强，其中LR-NK细胞特异性地分泌细胞因子-趋化因子，而cNK细胞特异性地分泌抗体依赖性细胞毒性。此外，肝脏中的直接离体流式细胞术分析显示CXCR6+CD69+NK簇逐渐富集，而qHBsAg水平下降（图3D）。
图3 FC 患者显示肝内NK细胞处于启动状态
三、研究结论
CHB和FC中的肝内环境显示出与匹配的PBMC中发现的细胞身份和分子特征不同的特定细胞身份和分子特征。FC与适应性免疫反应改变的出现有关，该反应以CD4细胞毒性T淋巴细胞为标志，并激活先天性反应。达到FC的患者中存在表达MHCII类的肝细胞，以及cccDNA和前基因组RNA的低但持续水平，这可能在FC中发挥重要作用。
研究为HBV治愈的免疫病理学控制提供了概念上的新见解，并为临床管理、生物标志物发现和治疗开发开辟了令人兴奋的新途径。这项研究的发现可能对慢性病毒性肝炎的解决具有更广泛的意义，因为它与激活先天和改变的免疫反应有关，这种免疫反应可能促进持续的低度炎症。
参考文献：
Narmada BC, Khakpoor A, Shirgaonkar N, Narayanan S, Aw PPK, Singh M, Ong KH, Owino CO, Ng JWT, Yew HC, Binte Mohamed Nasir NS, Au VB, Sng R, Kaliaperumal N, Khine HHTW, di Tocco FC, Masayuki O, Naikar S, Ng HX, Chia SL, Seah CXY, Alnawaz MH, Wai CLY, Tay AYL, Mangat KS, Chew V, Yu W, Connolly JE, Periyasamy G, Plissonnier ML, Levrero M, Lim SG, DasGupta R. Single-cell landscape of functionally cured chronic hepatitis B patients reveals activation of innate and altered CD4-CTL-driven adaptive immunity. J Hepatol. 2024 Jul;81(1):42-61. doi: 10.1016/j.jhep.2024.02.017. Epub 2024 Feb 28. PMID: 38423478.
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