转自：iSynFox
作者：Erin A. Essington, Grace E. Vezeau, Daniel P. Cetnar, Emily Grandinette, Terrence H. Bell, Howard M. Salis
接收时间：22 July 2024
https://doi.org/10.1038/s41467-024-54866-y
Nature Communications 影响因子：16.6
背景介绍
微生物经过工程化改造后，能够感知特定的化学物质，这在环境监测和地理空间探测中具有重要应用。但在自然环境中，这些改造微生物与本土微生物之间的竞争关系，对其长期效能的影响仍是一个未解之谜。
本研究中，科研人员在土壤细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中构建了传感器和记忆存储遗传回路，旨在探测TNT炸药并维持长期响应。通过运用预测模型，研究人员设计了核糖开关传感器，对转录速率进行了精细调整，并优化了遗传回路的动态范围。研究进一步对这些自主微生物传感器在天然土壤环境中检测TNT的能力进行了表征，监测了它们在28天周期内单细胞和种群水平的行为变化。结果表明，这些传感器在接触到低浓度TNT时反应活性增强了14倍，并且能够维持超过21天的稳定激活状态。在种群水平上，它们的活性呈现出指数衰减的动态变化，半衰期约为5天。总体上，这项研究证实了自主微生物传感器能够对天然土壤中的关键化学物质进行长期监测，并且它们的竞争性生长特性为生物安全性提供了额外保障。
图文解读
图1|在土壤中检测TNT的合成基因回路
A 工程化的枯草芽孢杆菌细胞在土壤中与自然微生物竞争，感知TNT，使用光学或嗅觉输出信号传输反应信息，以进行远程检测。
B 工程化的合成基因回路包含细胞感知、记忆和响应模块。一个组成型启动子转录一个TNT感应的核糖开关，激活位点特异性整合酶的翻译。一个反义启动子通过转录干扰减少传感器的泄漏。当表达时，整合酶结合到attB/attP位点并翻转一个启动子区域的方向。当翻转时，启动子表达输出响应模块。模块使用转录终止子进行隔离。
图2|TNT感应核糖开关的设计和特性
A Riboswitch Calculator模型预测了RS14核糖开关在未诱导（35 µM TNT）之前和之后的mRNA结构。"OFF"状态（状态1）显示了TNT未结合时计算的mRNA结构和翻译启动率（rTL,OFF）。"ON"状态（状态4）显示了当TNT完全结合到其适配体上，并且核糖体结合到mRNA上时，mRNA结构和翻译率的变化（rTL,35mM）。核苷酸根据它们的相互作用进行颜色编码，（浅蓝色）TNT适配体序列，（绿色）Shine-Dalgarno序列（SD），（深蓝色）16S核糖体RNA的最后9个核苷酸，以及（粉红色）mRFP1的起始密码子。橙色条是启动的核糖体足迹。对于核糖开关特性的描述，我们在上游添加了一个强的B. subtilis启动子来测量（B）mRFP1荧光水平和（C）TNT-RS14核糖开关菌株（紫色点）和mRFP1仅对照（黄色方块）对不同浓度TNT（高达35 µM）的响应的增长率（翻倍时间，以分钟计）。数据点和误差条是N = 3个生物学重复的平均值和标准差。RFU是相对荧光单位。
A TNT通过与RS14核糖开关结合激活合成基因回路，这激活了Int2重组酶的表达。Int2重组酶结合到att识别位点并翻转可切换状态的启动子方向，从而激活mRFP1报告基因（输出模块）的表达。设计的正向启动子控制编码RS14核糖开关和Int2重组酶的mRNA的转录速率。设计的反义启动子控制由于转录干扰而减少的mRNA水平。
数字是预测的转录和翻译速率。
B 在液体培养中指数生长期间，携带表现最佳的合成基因回路的工程化B. subtilis细胞对不同TNT浓度（0, 15, 25, 和 35 µM）的平均mRFP1荧光水平。条形图和误差条是3个生物学重复的平均值和标准差。点是单独的数据点。
数字是具有统计显著性的激活比率（双尾T检验p值分别为0.0263和0.0112）。
C 这些工程化B. subtilis细胞对每种TNT浓度的响应与野生型对照（无mRFP1）的单细胞mRFP1荧光分布图。
D 在相同条件下生长的携带不同合成基因回路的工程化B. subtilis细胞的平均mRFP1荧光水平，比较0 µM TNT（蓝条）与35 µM TNT（红条）时的反应。条形图和误差条是3个生物学重复的平均值和标准差。点是单独的数据点。数字是具有统计显著性的激活比率（双尾T检验p值分别为0.0337, 0.0329, 1.2E-05, 0.000196, 2.8E-06, 0.0195）。所有星号表示基于p值阈值的比较的统计显著性（*0.05, **0.01, ***0.001）。
E) 转录干扰和F) 核糖开关调控的定量模型显示了正向启动子和反义启动子转录速率的变化如何改变Int2 mRNA水平和翻译激活。转录速率预测使用启动子计算器v1.0尺度显示。RFU是相对荧光单位。
A 在自然土壤中表征TNT感应自主微生物传感器的功能和持久性的实验工作流程和测量时间线。对土壤样本的测量包括定量PCR（qPCR）、菌落形成单位（CFUs）、流式细胞术（FLOW）和下一代测序（NGS）。
B 在0 mg TNT/kg土壤（蓝色圆圈）、4.5 mg TNT/kg土壤（绿色方块）、45 mg TNT/kg土壤（红色菱形）和110 mg TNT/kg土壤（棕色星号）中，测量了TNT感应自主微生物在自然土壤中的红色荧光水平，为期28天。
C 在不含TNT的自然土壤中，测量了WT B. subtilis细胞（灰色三角形）、仅含mRFP1的B. subtilis细胞（橙色菱形）和未添加细胞对照（紫色八边形）的红色荧光水平，为期28天。
D 在含4.5 mg TNT/kg土壤（绿色条）、45 mg TNT/kg土壤（红色条）和110 mg TNT/kg土壤（棕色条）的自然土壤中，测量了TNT感应自主微生物传感器的mRFP1激活比率，为期28天。条形图和误差条是3个生物学重复的平均值和标准差。点是单独的数据点。星号比较的统计显著性通过双尾T检验p值量化（0.000003, 0.0001, 0.0021, 0.000049, 0.0000047, 0.00021, 0.000091, 0.0000006, 0.000495, 0.01198, 0.00060, 0.037026, 0.009956, 0.00448）。
E 在含不同TNT量的自然土壤中，自主微生物传感器的百分比，为期28天。
F 在不含TNT的自然土壤中，自动荧光对照细胞的百分比，为期28天。
G 在不同条件下，含不同TNT量的自然土壤中其他自然微生物细胞的百分比，为期28天。
H 从含不同TNT量的自然土壤样本中，测量了自主微生物传感器在选育琼脂平板（LB/Cm5）上的细胞活菌计数。
I 从含对照的自然土壤样本中，测量了在选育（LB/Cm5）或非选育（LB）琼脂平板上的细胞活菌计数。
J 通过qPCR测量了含不同TNT量的自然土壤中自主微生物传感器基因组的拷贝数。数据点和误差条是（B–I）3个或（J）2个生物学重复的平均值和标准差（独立土壤容器），每个重复有（B–I）3个或（J）2个技术重复（每个容器的样本）。RFU是相对荧光单位。
（转载仅供交流学习使用，侵权必删）
【点击下方超链接阅读16个栏目推文】
| 1.【直播】 | 9.【院士】 |
| 2.【视频】 | 10.【综述】 |
| 3.【健康&毒理】 | 11.【写作】 |
| 4.【水】 | 12.【Nature】 |
| 5.【气】 | 13.【Science】 |
| 6.【土】 | 14.【WR】 |
| 7.【固废】 | 15.【EST】 |
| 8.【生态】 | 16.【JHM】 |
