不敢想象早学会“巨噬细胞焦亡”我得有多快乐！复旦大学团队结合“泛素化”打造保姆级创新研究思路，学到手直接无痛发刊！

文摘 2024-11-04 18:02 上海

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1、这项研究通过CRISPR-Cas9基因敲除、模型构建等方法报道了REGγ抑制通过调节巨噬细胞中gasdermin家族的成员促进焦亡。从机制上讲，REGγ直接降解Bim，Bim是Bcl-2家族的一个因子，可以抑制GSDMD/E的切割，最终防止焦亡的发生。

2、这项研究的创新之处在于：①Bim以前是一种与细胞焦亡和脓毒症调节无关的蛋白，现在首次被揭示其在控制炎症细胞死亡中发挥作用，这标志着其在脓毒症治疗中的潜在意义；②发现了Bim敲除可以减轻由REGγ表达缺陷引起的焦亡，并减少焦亡诱导的炎症因子释放。因此，它在脓毒症中起调节作用。（ps：亲爱的小伙伴们，祝大家每日安康哦~另外想要进行相关热点方向的课题设计评估和生信分析的宝子们快来扫码联系大海哥吧！简直不敢想有了大海哥的专业加持大家会变成一个多么快乐的人儿，赶快行动吧~）

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题目：Bim的泛素非依赖性降解阻断了脓毒症相关组织损伤中巨噬细胞焦亡

杂志：Cell Death & Disease

影响因子：IF=8.1

发表时间：2024年9月

公众号后台回复关键词“999”即可获得原文，文献编号：241104

研究背景

脓毒症是一种威胁生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起。脓毒症和脓毒性休克是主要的卫生保健问题，每年影响全球数百万人，其中三分之一到六分之一的人死亡。此外，焦亡作为gasdermin介导的一种关键免疫相关的炎症性程序性细胞死亡方式，其在脓毒症中可能扮演重要角色。然而，尽管已有一些研究，但脓毒症的具体作用机制及潜在治疗靶点仍难以明确。

研究思路

研究结果

1.REGγ的缺乏促进了焦亡细胞的死亡

研究结果显示，暴露于顺铂6小时后，HeLa shREGγ细胞的PI吸收显著高于HeLa shN细胞，表明REGγ缺失细胞的细胞死亡倾向更大，伴有膜破裂。此外，在流式细胞术分析中使用Annexin V-APC和PI染色的时间过程研究也显示了类似的结论。HeLa shN和shREGγ细胞中Annexin V和PI双阳性死亡细胞的比例差异显著，其中后者较高。有趣的是，HeLa shREGγ细胞倾向于呈现阳性双染色，而不是典型的Annexinv阳性染色，提示细胞早期凋亡。因此，研究者们观察了用顺铂处理后的HeLa细胞的形态。在相同的条件下，HeLa shN细胞和shREGγ细胞均表现出由质膜肿胀引起的大气泡，这是焦亡的典型特征。值得注意的是，HeLa shREGγ细胞比HeLa shN细胞表现出更高的焦亡样细胞形态。此外，在HeLa shREGγ细胞中，全长GSDME（GSDME-FL）及其N端裂解产物（GSDME-NT）在顺铂刺激下均上调。Caspase-3被激活，PARP被裂解。REGγ还显著降低了乳酸脱氢酶（LDH）的释放，表明REGγ的抑制恶化了细胞膜完整性的中断。综上所述，REGγ抑制可通过间接调控巨噬细胞和肿瘤细胞中的GSDME和GSDMD来促进细胞焦亡。

图1 REGγ的缺乏促进了焦亡细胞的死亡

2.Bim的缺失减轻了REGγ缺失对焦亡的促进作用

接下来重点研究了一种促凋亡蛋白Bim，它可以激活Bax/Bak的同源齐聚，从而促进细胞死亡。在HeLa细胞和BMDMs中，Bim表达显著上调，而RNA水平没有伴随的变化。敲除Bim减轻了HeLa细胞中敲除REGγ导致的细胞膜完整性中断。同样，与HeLa shREGγ细胞相比，HeLa Bim-knockout-shREGγ细胞表现出显著降低的焦亡特性，如Hoechst 33342/PI染色和流式细胞术分析所示。在HeLa bim敲除-shREGγ细胞中，GSDME-NT在顺铂刺激下继续产生，但显著减少和延迟，与激活的半胱spase-3的减少相一致，表明焦亡程度降低。沉默Bim部分抑制了顺铂诱导的HeLa细胞焦亡。Bim敲除作为线粒体凋亡通路的上游调控蛋白，也通过抑制裂解PARP的表达来影响细胞凋亡。综上所述，下调Bim表达可以缓解REGγ缺失引起的焦亡增加。

图2 Bim的缺失减轻了REGγ缺失对焦亡的促进作用

3.REGγ介导的非泛素-ATP依赖性的Bim降解

Bim主要有三个亚型，BimS、BimL和BimEL，它们在N端和C端序列相似性较高。REGγ和Bim之间的物理相互作用已经在相互的共免疫共沉淀分析中得到证实，REGγ与Bim的所有三个主要亚型结合。在蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理下，在REGγ缺失时，Bim显著稳定。抑制REGγ显著减缓了Bim的降解，证实了REGγ在促进Bim降解中的作用。将不同浓度的REGγ质粒转染到REGγ-缺失表达的293T细胞中，同时加入一定浓度的Bim质粒，结果显示Bim的表达与REGγ的浓度呈负相关。进一步纯化了REGγ，可在体外降解Bim。体外翻译的Bim与纯化的REGγ和20S蛋白酶体孵育，显示Bim被REGγ-20S蛋白酶体直接降解。总之，这些发现共同表明，Bim是REGγ的底物，它被REGγ-20S蛋白酶体以泛素化和atp独立的方式降解。

图3 REGγ介导的非泛素-ATP依赖性的Bim降解

4.盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的脓毒症下调了REGγ的表达

为了研究REGγ在脓毒症中的作用，研究者们通过CLP 在6-10周龄的C57BL/6 WT雄性小鼠中建立了体内脓毒症模型。通过比较两组的湿干重比，发现CLP诱导脓毒症小鼠的肝和肺存在水肿。通过H&E染色观察到肝、肾水肿，脾脏白髓广泛减少，肺内肺泡壁增厚，形成透明膜，各种组织均有炎症细胞浸润。丙氨酸转氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）和血尿素氮（BUN）水平分别表明肝脏、心脏和肾脏受损。这些指标在CLP诱导的脓毒症模型小鼠中均有升高，提示发生了与脓毒症症状相一致的多器官损伤。这些结果提示，CLP可成功诱导脓毒症。免疫印迹分析显示，REGγ的表达显著下调。同时，GSDMDNT的表达水平增加，表明在这些REGγ表达下调的样本中存在焦亡。此外检测REGγ的转录水平发现，在CLP组中显著降低。肺内的免疫荧光检测也显示，在CLP诱导的脓毒症小鼠中，REGγ的表达降低。这些数据表明REGγ与焦亡和脓毒症呈负相关，提示REGγ通过调节焦亡在脓毒症的发生发展中发挥重要作用。

图4 盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的脓毒症下调了REGγ的表达

5.脓毒症患者临床样本中REGγ表达降低

研究者们从GEO数据库中获得了脓毒症患者血液样本的RNAseq分析数据，并REGγ 表达进行了比较分析。结果显示，与健康个体相比，脓毒症患者全血样本中 REGγ 表达水平显著降低。GSE100159数据库中两名从脓毒症中恢复的患者显示REGγ表达恢复，表明REGγ在脓毒症中具有调节作用。分离人外周血单核细胞后分析显示，REGγ在临床脓毒症样本中表达下调，提示REGγ确实在一定的致病因素下影响脓毒症患者。患者资料显示，脓毒症患者多感染细菌，引起肺损伤。最后选择铜绿假单胞菌（PA）分别感染两种不同浓度的WT小鼠，并检测REGγ的表达。REGγ在肺中的表达下调，而在结肠中没有表达下调。同样，采用免疫印迹法检测CLP术后肺、结肠和小肠中REGγ的表达情况。REGγ仅在肺中显著下调。H&E染色显示严重的肺损伤，肺组织免疫荧光结果也显示PA感染小鼠的REGγ降低。总之，REGγ在脓毒症中下调，并可能影响脓毒症引起的肺损伤。

图5 脓毒症患者临床样本中REGγ表达降低

6.CLP诱导的脓毒症因REGγ的无表达而加重

为了进一步明确REGγ在脓毒症中的潜在治疗价值，研究者们以实验室固有的REGγ^-/- C57BL/6小鼠和WT C57BL/6小鼠作为对照，构建了CLP脓毒症模型。在CLP手术后10天内，REGγ^-/-小鼠的死亡率明显高于WT小鼠。比较CLP手术前后小鼠的体重发现，REGγ^-/-小鼠的体重减轻量少于WT小鼠。与WT小鼠相比，REGγ^-/-小鼠在CLP手术后产生了更多的炎症因子，提示有严重的炎症反应。采集脓毒症小鼠的血液进行生化分析。REGγ^-/-小鼠和WT小鼠的BUN、CK和ALT水平均显著上调，表明肾、心和肝损伤，REGγ^-/-mic水平分别升高。H&E染色显示REGγ^-/-脓毒症小鼠的组织损伤更严重，包括更严重的细胞死亡和炎症细胞浸润。这些数据都表明，REGγ的消除会导致更严重的脓毒症相关症状，包括炎症和组织损伤，突出了REGγ在脓毒症发展中的关键作用。此外，本文研究的焦亡上游调控因子Bim也在REGγ^-/- BMDMs中高表达。这些观察结果为REGγ对焦亡的调节作用可以影响脓毒症的严重程度提供了证据，为其治疗提供了新的见解。

图6 CLP诱导的脓毒症因REGγ的无表达而加重

文章小结

这项研究表明了：①REGγ通过降解Bim来调节焦亡，其对焦亡的抑制被证明在败血症的情况下是有利的；②Bim是一种以前与细胞焦亡和脓毒症调节无关的蛋白质，现在已被揭示在控制炎症细胞死亡中发挥作用，这标志着其在脓毒症治疗中的潜在意义。总之，本文的研究发现表明：REGγ-Bim轴对细胞焦亡的调节可以为各种炎症性疾病提供新的治疗策略。亲爱的宝子们，是不是很难想象“焦亡”还能这么做？！其实这些并不难做，都是你们一直想要的干湿套路的经典结合。需要思路设计或者生信分析小伙伴们，欢迎大家随时扫描下方二维码联系大海哥哦~“典藏”的模板可都在这儿啦~

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