2024年，英国格拉斯哥大学的Manuel Salmeron-Sanchez和Matthew J. Dalby在《Nature Communications》杂志上发表了题为"Bioengineered niches that recreate physiological extracellular matrix organisation to support long-term haematopoietic stem cells"的论文。
本文主要内容是关于如何通过生物工程方法创建一个能够模拟生理细胞外基质组织的微环境，以支持长期造血干细胞（LT-HSCs）的维持。研究团队利用软性I型胶原水凝胶来促进血管周围基质细胞（PerSCs）中巢蛋白（nestin）的表达，并通过这种方式维持LT-HSCs的数量和功能。研究表明，巢蛋白的表达对于PerSCs的细胞保护作用和代谢调控至关重要，这对于HIF-1α的表达和LT-HSCs的自我更新至关重要。此外，该研究还证明了这些生物工程微环境能够支持CRISPR编辑的HSCs的生存，为治疗血液疾病提供了潜在的影响。
01：摘要
长期重建性造血干细胞（LT-HSCs）通过干细胞移植被用来治疗血液疾病。LT-HSCs的极低丰度以及它们在体外培养过程中的快速分化，限制了它们的临床应用。之前使用基质饲养层、定义的培养基混合物和生物工程的发展，虽然使得造血干细胞（HSCs）在培养中得以扩增，但主要是短期HSCs和祖细胞群体，而牺牲了原始的LT-HSCs。在这里，我们报告了一种生物工程化的LT-HSC维持微环境的创建，这种微环境重现了生理细胞外基质的组织结构，使用软性I型胶原水凝胶来促进血管周围基质细胞（PerSCs）中巢蛋白的表达。我们展示了巢蛋白，这种由支持HSC的骨髓基质细胞表达的蛋白质，具有细胞保护作用，并通过代谢调控，对PerSCs中HIF-1α的表达至关重要。当CD34+的HSCs被添加到包含表达巢蛋白/HIF-1α的PerSCs的生物工程微环境中时，LT-HSCs的数量得以维持，具有正常的克隆和体内重建潜力，而无需培养基补充。我们提供了概念验证，证明我们的生物工程微环境可以支持CRISPR编辑的HSCs的生存。成功地在体外编辑LT-HSCs可能对治疗血液疾病产生潜在影响。
02：图文赏析
体外再现内皮表面
骨髓微环境包含不同的假定区域，这些区域在造血干细胞（HSC）调控中扮演不同的角色。窦状（中央骨髓腔）微环境与窦状毛细血管相关，相对于其他骨髓区域更加缺氧，自我更新的短期造血干细胞（ST-HSCs）被认为居住在那里。内皮表面，紧邻大量含氧小动脉网络，被认为保留了更静止的长期造血干细胞（LT-HSCs）池。骨髓还拥有一个密集的细胞外基质（ECM）网络，其成分在内皮和窦状微环境之间交换（图1）。在内皮表面，ECM更硬且富含纤维连接蛋白（FN）。向中央骨髓腔的窦状微环境过渡，ECM逐渐变得更不硬，且富含胶原蛋白和层粘连蛋白39,40。ECM蛋白的构象以及它们的类型和密度，都强烈影响骨髓细胞的相互作用41。我们之前的研究表明，纤维状FN可以有效地结合并呈现骨形态发生蛋白2（BMP-2，一种成骨生长因子），在体外促进骨髓间充质干细胞（MSCs）的成骨，并在体内促进骨折愈合35,36。我们在这里将这些发现适应于重现更静止的内皮微环境的ECM特性。聚乙烯丙烯酸酯（PEA）导致FN自发展开（图2a），通过原子力显微镜（AFM）可视化（图2b，补充图1a）。这种细胞驱动的展开过程导致FN分子中关键结合域的暴露42。化学上类似的聚甲基丙烯酸酯（PMA）在这里用作参考聚合物，FN在其上被吸附并保持球形构象（图2b，补充图1a）。PMA在表面润湿性和硬度方面与PEA表现相似43，但FN的吸附增加（图2c）。通过荧光检测识别总FN的抗体（图2d，补充图1b），FN的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）包含的HFN7.1整合素结合域（图2e），以及其P5F3生长因子结合域（图2f）显示，当被PEA吸附时，这些FN域的可用性显著增加，相对于PMA。特别是FN的P5F3域，对几个生长因子家族具有高结合亲和力44。在这里，我们展示了外源性BMP-2与PEA-FN结合（图2g），允许我们向细胞呈现这种与内皮相关的低水平生长因子。尽管相似数量的BMP-2也与PMA结合，但我们之前的研究表明BMP-2在PMA上不与FN共定位，导致其更快的释放35,36。因此，在这项研究中，我们使用PEA来呈现FN和BMP-2，重现支持我们骨髓模型中HSC静止（维持）的内皮表面环境。
PerSC表型的控制
骨髓微环境的基质细胞群是高度异质性的。报告的标记物表达，如巢蛋白、神经胶质抗原2（NG-2）和瘦素受体（LEPR），表明血管周围基质细胞（PerSCs）和间充质干细胞（MSCs）具有支持造血干细胞（HSC）调控的表型。在这里，我们专注于调控长期造血干细胞（LT-HSCs）的PerSCs，这些细胞排列在内皮动脉上，以及巢蛋白。巢蛋白是一种细胞骨架中间丝（IF）蛋白，传统上与神经前体细胞相关。在体内小鼠骨髓研究中已经显示，巢蛋白阳性的PerSCs表达高水平的与HSC维持相关的因子，如干细胞因子（SCF）。先前的重要研究还表明，基质细胞在对柔软材料的反应中表达巢蛋白。因此，我们使用了低刚度的I型胶原水凝胶，这是骨髓细胞外基质（ECM）的主要组成部分，来研究巢蛋白在人类PerSCs中的表达作用，以及这如何影响它们与体外HSCs的相互作用。我们注意到PerSCs与MSCs具有类似的多能性（补充图2）。这些胶原凝胶，具有约80帕的杨氏模量以模拟骨髓HSC微环境的硬度，被覆盖在培养在PEA/FN/BMP-2表面的PerSCs上（图3a，b，补充图3）。我们还使用了降低氧张力（1% O2，缺氧）的PEA/FN/BMP-2，因为缺氧被认为是在骨髓环境中维持基质HSC支持表型的重要因素（图3a）。我们观察到在我们的生物工程PEA/FN/BMP-2微环境中加胶（表示为+gel），巢蛋白在PerSCs中在第7天显著上调（图3c），增强的巢蛋白表达持续到第14天（补充图4a）。相比之下，在没有加胶的PEA/FN/BMP-2微环境中（表示为-gel）、PEA/FN/BMP-2缺氧微环境中以及有和没有胶的PMA/FN/BMP-2微环境中，巢蛋白都以基础水平表达（补充图4a）。我们使用玻璃盖片上的PerSCs作为培养对照，因为它们不会在没有蛋白质界面的高度疏水的PEA上附着（图3c-f）。因此，只有当胶在PEA展开的FN上被包含时，才会诱导巢蛋白的表达。巢蛋白是一种IV型IF蛋白，无法自我聚合。因此，它与其他II型和IV型IFs共聚。因此，我们检查了在间充质谱系细胞中表达的IF蛋白——波形蛋白的表达，并发现波形蛋白的表达或其形态没有显著差异（图3d）。
BM生态位的代谢调节
为了进一步阐明低氧在骨髓微环境中的作用，我们利用我们的模块化平台，研究了低氧和硬度对基质微环境表型的影响，并比较了我们生物工程模型中低氧的效应。HIF1α是代谢的主调控因子。它调节包括厌氧糖酵解在内的糖酵解和氧化磷酸化。因此，我们评估了在生物工程微环境中培养3、7和14天后，PerSCs中HIF1α的表达模式。HIF1α是恒定产生的，但在正常氧条件下被羟化，这抑制了其转录活性，并使其成为大多数细胞中泛素化和降解的目标。然而，在低氧条件下，它变得稳定，转移到细胞核并激活低氧反应基因的转录。因此，我们选择研究HIF1α的核表达（图5a，补充图7a-c）。通过这种测量，所有三种生物工程模型都导致PerSCs中HIF1α蛋白的核表达增加。然而，有趣的是，+gel微环境中的细胞在所有时间点显示出显著更多的核HIF1α表达，与-gel和低氧模型相比；+gel微环境还支持具有最类似微环境表型的PerSCs（图3c-h）。尽管一些低氧反应基因在+gel微环境中的PerSCs中上调（补充图6c），我们对HIF1α下游靶标（如VEGF（图5b）、乳酸和乳酸脱氢酶（LDH）（补充图7d，e））的研究表明，表达并没有增加。为了确定+gel微环境中的PerSCs是否经历了低氧张力，我们接下来使用了pimonidazole，一种低氧探针。探针显示，虽然在低氧张力模型中培养的PerSCs明显处于低氧状态，但-gel模型和+gel微环境中的细胞并非如此（图5c）。这表明，在+gel微环境中表达核HIF1α的PerSCs并非是响应降低的氧张力。为了识别微环境模型中PerSCs的代谢变化，进行了液相色谱-质谱（LC-MS）分析，以识别在培养7天和14天时代谢组的变化。所有代谢物的主成分分析（PCA）表明，所有三种培养条件在PC 1与PC 2中没有重叠聚集，而在第14天的PC 2与PC 3中，+gel和低氧微环境有一些重叠（图5d，补充图8）。然后，仅关注糖酵解和TCA循环代谢物（图5e），发现在低氧模型中预期的糖酵解代谢物簇的增加，以及在-gel模型中TCA相关代谢物的上调，这与活跃的分化一致。有趣的是，对于+gel微环境，我们观察到糖酵解和氧化磷酸化的总体下调，而不是糖酵解的增加（图5e）。
巢蛋白是生态位代谢调节所必需的
关于为什么巢蛋白在骨髓微环境的基质细胞中高度表达，人们知之甚少。我们已经展示了在+gel微环境中巢蛋白水平有所增加（图3c），而中间丝（通过波形蛋白测量）却没有（图3d）。为了确认这一观察结果，我们使用针对p(Thr316)-巢蛋白的抗体评估了巢蛋白整合到中间丝网络中的情况。当这个位点磷酸化时，会促使巢蛋白从中间丝纤维中解聚。我们观察到在+gel微环境中的PerSCs中p(Thr316)巢蛋白显著上调，表明并非所有巢蛋白都整合到细胞骨架中。这表明巢蛋白在我们的工程化骨髓微环境中基质细胞的功能并不完全依赖于其在细胞骨架中结构性的作用（图6a，补充图9）。由于我们观察到HIF1α，以及可溶性巢蛋白在其他细胞类型中与细胞保护相关55-57，我们接下来探讨了两种可能性：(1)巢蛋白的表达与HIF1α有关，在PerSCs表达高水平巢蛋白的微环境中，对氧化应激的细胞死亡反应较低（图6d）。通过siRNA敲低减少巢蛋白，导致对氧化应激的敏感性增加，在+gel微环境中观察到PI阳性细胞显著增加（图6e，补充图10c, d；注意所有条件都含有H2O2）。这些结果与有关氧化应激对神经前体细胞影响的报告一致，其中巢蛋白阳性细胞对由H2O2诱导的凋亡驱动的氧化应激更具抵抗力57。
3：原文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-024-50054-0
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