胸科之窗
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作者：甄俊峰1，张超2，黄婷婷1，谢龙祥3，闫亚如1，鄢双全4，张景涵1，黄海荣2，谢建平1
作者单位：1西南大学生命科学学院现代生物医药研究所；2首都医科大学附属北京胸科医院；3河南大学基础医学院；4上海交通大学生命科学与生物技术学院
通信作者：谢建平，Email: georgex@swu.edu.cn ；黄海荣，Email: huanghairong@tb123.org
Drug repurposing: An antidiabetic drug Ipragliflozin as Mycobacterium tuberculosis sirtuin-like protein inhibitor that synergizes with anti-tuberculosis drug isoniazid.
Zhen J, Zhang C, Huang T, Xie L, Yan Y, Yan S, Zhang J, Huang H, Xie J.
Int J Biol Macromol, 2024 Oct 29:137003.
doi: 10.1016/j.ijbiomac.2024.137003. Online ahead of print.
PMID: 39481722.
耐药结核病、HIV合并感染、糖尿病合并结核病等都使得结核病控制更加棘手。新的药物或者老药新用则是实现结核病控制目标的关键之一。
近日，西南大学生命科学学院现代生物医药研究所谢建平课题组联合首都医科大学附属北京胸科医院黄海荣课题组在International Journal of Biological Macromolecules杂志（中国科学院JCR一区，影响因子7.7）上发表了题为Drug repurposing: An antidiabetic drug Ipragliflozin as Mycobacterium tuberculosis sirtuin-like protein inhibitor that synergizes with antituberculosis drug isoniazid的研究论文（https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813024078127?via%3Dihub）。该研究发现抗糖尿病药物Ipragliflozin（伊格列净）通过靶向结核分枝杆菌去乙酰化/去琥珀酰化双功能酶Rv1151c而对结核分枝杆菌具有较强的杀灭活性，同时，伊格列净与一线抗结核药物异烟肼具有协同作用。更重要的是，作为一种抗糖尿病药物，伊格列净有望被纳入治疗糖尿病合并结核病的方案中。
研究目的
蛋白质赖氨酸乙酰化是所有生命中普遍存在的翻译后修饰，影响数百个具有各种功能的蛋白质。赖氨酸琥珀酰化作为一种新发现的蛋白质翻译后修饰参与调节细菌和哺乳动物细胞中各种生物过程。目前，研究者已经完成了结核分枝杆菌的全局性琥珀酰化蛋白鉴定工作，并发现一些与毒力、群体感应和代谢等生理途径相关的蛋白质存在琥珀酰化修饰。Rv1151c 作为结核分枝杆菌中负责赖氨酸去乙酰化和去琥珀酰化修饰的双功能酶在多个环节中扮演重要角色，这有助于理解（去）酰化调节酶可能是开发抗结核治疗干预措施的潜在靶标。
研究方法
1. 通过基于结构的虚拟筛选对来自7个化合物库中的31 057个配体化合物进行初筛。随后对这些化合物进行标准精度（standard precision，SP）筛选和额外的精确度（extra precision，XP）对接，以进一步确定最高命中数。采用Desmond分子动力学系统进行传统分子动力学模拟以确定候选化合物与Rv1151c的结合稳定性。
2. 通过最小抑菌浓度和生长曲线检测伊格列净对结核分枝杆菌的抗菌活性，棋盘法确定伊格列净与异烟肼具有协同作用。
研究结果
一、虚拟筛选寻找Rv1151c抑制剂
研究首先通过AlphaFold3对Rv1151c蛋白晶体结构进行预测，并通过薛定谔软件进行处理。处理后的结构用于活性位点识别和结构分析。综合得分最适的活性位点被选作活性口袋进行研究。随后通过基于结构的虚拟筛选对7个化合物库中的31 057个配体化合物进行筛选，并通过分级筛选策略在保证筛选效率的同时提高筛选的准确性和可靠性。
图1 使用7个不同的数据库针对Rv1151c蛋白进行基于结构的多阶段虚拟筛选
二、伊格列净是Rv1151c的抑制剂
根据对接结果分析发现伊格列净和化合物CHEMBL443638的综合得分最高。综合ADME/T评估、XP对接、MM-GBSA分析及3D对接视图结果，表明伊格列净、CHEMBL443638这两个化合物与Rv1151c有稳定的结合，且具有更佳的成药性。
图2 Rv1151c蛋白的结合位点预测和对接分析
三、伊格列净与Rv1151c蛋白稳定结合
研究首选治疗糖尿病的药物伊格列净进行研究。在100 ns模拟中分析了Rv1151c在全局（RMSD）和残基（RMSF）水平上的构象灵活性, 以预测结构稳定性。如图3表明伊格列净能够与Rv1151c稳定结合。
图3 伊格列净与Rv1151c结合的分子动力学模拟分析
四、伊格列净抑制结核分枝杆菌生长
随后，研究使用结核分枝杆菌标准菌株H37Rv和不同的临床分离菌株进行抗菌活性测定。发现伊格列净对H37Rv的最小抑菌浓度为0.1 mg/ml，对于其他临床分离菌株的最小抑菌浓度则在0.05～0.1 mg/ml之间。同样，H37Rv菌株在不同浓度伊格列净存在时生长受到明显抑制，并呈现剂量依赖性。这表明伊格列净可以通过靶向Rv1151c抑制结核分枝杆菌生长。
图4 伊格列净抑制结核分枝杆菌生长
五、伊格列净促进异烟肼杀灭结核分枝杆菌
继而，研究使用棋盘法探究伊格列净与异烟肼之间的关系。1/2 MIC异烟肼与不同浓度的伊格列净合用可显著抑制结核分枝杆菌H37Rv的生长，1/4 MIC异烟肼与1/2MIC伊格列净合用可轻微抑制结核分枝杆菌H37Rv的生长，表明伊格列净与异烟肼有协同作用。说明在结核病的临床治疗中，伊格列净既可以作为单药使用，也可以与异烟肼联合作为增效剂。
注 红色框内为协同作用效果，右图为96孔板加样图示
图5 伊格列净促进异烟肼对结核分枝杆菌的杀伤
六、伊格列净通过靶向Rv1151c改变结核分枝杆菌全局酰化水平
为了确认伊格列净发挥抗结核分枝杆菌作用是由于抑制Rv1151c所致，研究者敲除了Rv1151c在耻垢分枝杆菌的同源基因MSMEG5175，并检测结核分枝杆菌在伊格列净存在时的全局乙酰化/琥珀酰化水平。
图6 伊格列净通过靶向Rv1151c改变分枝杆菌全局乙酰化和琥珀酰化水平
研究结论
研究通过基于结构的虚拟筛选，针对结核分枝杆菌去乙酰化/去琥珀酰化双功能酶 Rv1151c筛选了来自不同化合物库的小分子，并通过严格的多阶段分子对接程序鉴定了潜在的抑制剂。随后通过分子动力学模拟建立了Rv1151c-伊格列净相互作用的动力学。生化检测表明，伊格列净对Rv1151c具有较强的抑制作用，不仅对结核分枝杆菌表现出较强的杀菌活性，而且与一线抗结核药物异烟肼具有协同作用。更重要的是，伊格列净本身是作为SGLT-2抑制剂用于治疗糖尿病。总体而言，本研究为老药新用提供了基础，可能对糖尿病合并结核病患者的临床治疗或异烟肼增效剂的选择具有潜在的价值和意义。
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