2024年，Wei-Xiang Sin等人在Nature Biomedical Engineering杂志上发表了题为"A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells"的论文。
本文主要介绍了一种高密度微流控生物反应器，该反应器能够自动化生产CAR T细胞。研究团队展示了人类原代T细胞可以在一个2毫升的自动化封闭系统微流控生物反应器中被激活、转导并扩增到高密度，以产生可行的抗CD19 CAR T细胞。这些细胞在体外分泌细胞因子、短期细胞毒性活性、长期持久性和增殖能力，以及体内抗白血病活性方面，与在透气孔板中生产的T细胞相当。此外，该微流控生物反应器的制造过程强化可能有助于分析CAR T细胞在体外培养期间的生长和代谢状态，高通量优化细胞制造过程，并实现细胞治疗制造的规模化。
01：摘要
自体嵌合抗原受体（CAR）T细胞的制造在很大程度上要么依赖于补料分批和手动过程，这些过程往往缺乏环境监测和控制，要么依赖于难以扩大规模以满足患者需求的生物反应器。在这里，我们表明，人类原代T细胞可以在2毫升自动封闭系统微流体生物反应器中被激活、转导和扩增到高密度，以产生活的抗CD19 CAR T细胞（具体来说，来自淋巴瘤患者的供体细胞的6000多万CAR T细胞和来自健康供体的2亿多CAR T细胞）。细胞因子的体外分泌、细胞产物的短期细胞毒性活性和长期持续性和增殖，以及它们的体内抗白血病活性，与透气孔中产生的T细胞相当。小型化可灌注生物反应器实现的制造过程强化可以促进体外培养期间CAR T细胞生长和代谢状态的分析、细胞制造过程的高通量优化和细胞治疗制造的规模化。
02：图文赏析
微生物反应器与透气性孔板上CAR - t细胞工艺的建立
虽然Breez之前已经证明可用于哺乳动物细胞系的培养50，51，但其在任何人类原代细胞培养或自体细胞治疗产品生产中的应用尚未见报道。因此，我们着手建立适用于微生物反应器的CAR-T细胞生产方案并对其进行基准测试。微生物反应器的设计和特征在之前已有详细描述45，46，52。Breez微生物反应器包括一个基站控制器和一个二氧化碳控制器，最多支持四个吊舱，每个吊舱可以容纳一个与瓶架组件相连的微流控芯片，作为无菌的一次性耗材提供（扩展数据图1a）。这种模块化设计允许每个仪器（宽（W）深（D）高（H），41厘米43厘米36厘米）最多四个独立培养物的高度并行同步或异步运行。微流控芯片或盒子（W D H，5 cm 8 cm 1 cm）包含一个2 ml培养体积的生长室；集成储液器、注射器、泵、阀门和孔径为1.2μm的聚醚砜灌注过滤器，用于细胞保留；以及嵌入式OD、溶解O2和pH传感器，这些传感器能够通过气动控制器对这些过程参数进行实时监测和闭环控制，该气动控制器可以调节生长室顶部空间中气体的O2和CO2浓度（图1a）。还有一个接种端口，用于将细胞或病毒载体引入生长室，还有一个取样端口，用于从生长室中取样细胞悬浮液（图1a）。塑料微流控芯片内的生长室由柔性透气聚二甲基硅氧烷硅胶膜定义，其周期性偏转可实现生长室的快速扩散气体转移和低剪切无气泡混合（图1b）。该盒与一个瓶架组件（W D H，10 cm 13 cm 18 cm）相连，该组件最多可提供四种流体输入，此外还有两种流体输出，即无细胞灌注输出和含细胞废物输出（扩展数据图1a）。在我们的实验中，使用了三种流体输入：用于连续灌注的培养基、用于蒸发补偿的水和用于pH调节的基本碳酸盐/碳酸氢盐溶液。当使用通过管焊机和管密封器的无菌连接时，这种封闭系统的微生物反应器可以在工作台上完全操作。在我们的概念验证实验中，细胞或病毒载体接种和细胞收集是通过在生物安全柜（BSC）中将注射器分别连接到接种端口或废液瓶来完成的，其余过程在BSC外的学术组织培养室设施中进行。
微生物反应器和透气孔板的 T 细胞活化水平和转导效率都很高，而且不相上下
在CAR - T细胞的产生过程中，起始T细胞必须被激活才能通过标准LVVs55进行转导。为了激活，我们将纯化的T细胞与CD3/CD28 Dynabeads (Thermo Fisher Scientific)混合在25毫升的管中，然后将细胞珠混合物接种到四个透气孔和四个微生物反应器盒中，每个供体使用相同的细胞密度(每毫升100万个细胞)，细胞珠比(1:1)和培养体积(2毫升含有200万个细胞)。(扩展数据图1e和补充图1a)。为了评估t细胞的活化水平，我们收集了转导前第1天从复制孔/盒中采集的细胞样本(由于起始细胞数量较少)，并对活化标记物CD69和CD25进行了流式细胞术分析(补充图1b)。我们观察到95%的细胞是CD69+或CD25+(图2a和补充图2a)，表明两种培养系统之间的t细胞活化水平相似。与此一致的是，低密度脂蛋白受体(水疱性口炎病毒g蛋白假型lvv的受体，已知在T细胞激活时上调55,56)的表达也与微生物反应器和透气性孔板中激活的T细胞相似(补充图2b)。接下来，我们用含有抗cd19 car的LVV共表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞转导感染多重性(MOI)为5。转导前第1天，微生物反应器内的总活细胞数低于气井;因此，在微生物反应器中进行转导所需的LVV量较低(补充图3a)。对于渗透性井，将1 ml无细胞培养基替换为1 ml含有稀释LVV的新鲜培养基，静培养24 h后，加入6 ml新鲜培养基，最终培养体积为8 ml(补充图1a)。对于微生物反应器，通过灌注输出除去1 ml无细胞培养基，然后通过接种口接种1 ml含有稀释LVV的新鲜培养基。在添加LVV后，生长室连续混合2小时，然后在剩余的过程中恢复间歇混合(补充图1a)。我们分析了基因组DNA的载体拷贝数，发现微生物反应器和透气孔板细胞的整合拷贝数相当，并且在美国食品和药物管理局推荐的每个基因组5个拷贝的范围内57(补充图3b,c)。我们在第6天和第12天通过流式细胞术进一步测量了GFP表达作为CAR表达的代理，发现CAR在两种培养系统中培养的T细胞上稳定表达(图2b和补充图3d g)。在微生物反应器和透气性孔板之间，CAR+ T细胞的百分比在总T细胞中大致相当，范围从60%到70% CAR+(图2b和补充图3d g)。这表明两种培养系统同样能够支持高转导效率。
毫升级灌注式微生物反应器使临床剂量水平的CAR - T细胞高密度生产成为可能
在微生物反应器和透气性孔板中证明了相同水平的激活和转导后，我们接下来评估了两种培养系统中CAR - t细胞的扩增率。与透气井相比，微生物反应器中的vcd在第6天增加了5倍，在第12天增加了10倍(图2c和扩展数据图2a和3a)。尽管微生物反应器中的细胞密度超过1.5亿个细胞/ ml，但细胞活力仍然很高，与气井中的细胞活力相当(图2d和扩展数据图2b和3b)。考虑到透气井的培养体积比微生物反应器大4倍，微生物反应器中的活细胞计数(vcc)在第6天略高，在第12天高2.5倍，car转导和非转导样品之间的vcc相似，表明慢病毒转导不影响细胞扩增(图2e和扩展数据图2c f和3c)，并且在运行之间具有与透气井相似的可变性。显示了微生物反应器过程的可重复性(扩展数据图2g)。这些vcc在微生物反应器中转化为超过400倍的累积倍数膨胀，而在透气井中则小于200倍(图2f和扩展数据图2h和3d)，这表明改善的介质交换和/或气体传输可能有助于微生物反应器中更好的CAR - t细胞膨胀。值得注意的是，最终VCC总T细胞超过3亿个，CAR+细胞超过60 - 70%，微生物反应器中CAR+活T细胞的最终数量超过2亿个(图2g和扩展数据图2i和3e)，满足了用于儿科/青少年b细胞急性淋巴细胞白血病和成人弥漫性大b细胞淋巴瘤的组织细胞(Kymriah)的最小细胞剂量，超过了用于成人弥漫性大b细胞淋巴瘤的轴细胞(Yescarta)的最大细胞剂量2。因此，临床剂量的抗cd19 CAR - T细胞可以在一个2ml的微流体盒中生产，从而大大增加了吞吐量，并提高了为多个患者并行扩展自体CAR - T细胞生产的能力。
来自两种培养系统的CAR - T细胞主要是Tn/Tscm和Tcm表型，并且在衰竭状态上表现出细微的差异
接下来，我们表征了在两种培养系统上产生的CAR - T细胞的表型(补充图4)。T细胞分离后获得了高CD3+纯度(补充图5a)，并且在两种培养系统的过程结束时都保持了这种纯度(补充图5b)。CD4+/CD8+比值随着培养时间的推移而下降，与供体a和C的透气井相比，微生物反应器中CD4+/CD8+比值下降的程度更大，与供体B的培养系统无关(图3a和补充图5c)。总的来说，CD4+/CD8+比值在两种培养系统中都没有明显偏斜。我们进一步通过流式细胞术对C-C基序趋化因子受体7 (CCR7)和分化45长异构体簇(CD45RA)进行染色，分析了两种培养体系上产生的CAR - T细胞的分化状态。第6天，在微生物反应器中，与透气井相比，初始/干细胞记忆(Tn/Tscm) (CCR7+ CD45RA+)区和中央记忆(Tcm) (CCR7+ CD45RA)区中与更长的体内持久性相关的亚群的细胞百分比略低(图3b)。虽然两种系统的Tn/Tscm和Tcm细胞的百分比随着培养时间的推移而下降，但在第12天也观察到微生物反应器和透气井之间的差异，前者具有更高百分比的分化效应记忆(Tem) (CCR7 CD45RA)和终末分化效应(Temra)细胞(CCR7 CD45RA+)(图3b和补充图5d)。细胞在分化亚群中的比例相似。
在微生物反应器上产生的CAR - T细胞在体内显示出抗白血病活性
在证明了2ml微流控生物反应器能够产生患者源性CAR - T细胞的能力后，我们在异种移植物NOD/SCID/ il2r γ缺失(NSG) b细胞白血病小鼠模型中评估了两种培养系统产生的CAR - T细胞和非转导T细胞，作为功能活性的额外证据。在植入nalm6 -荧光素酶细胞6天后，静脉注射来自成年淋巴瘤患者的等量CAR+活T细胞或相应数量的非转导T细胞(图6a)。在两种培养系统中产生的CAR - T细胞与各自的非转导对照相比，存活率显著增加，微生物反应器和透气井CAR - T细胞在CAR - T细胞治疗后6周的存活率没有统计学差异(图6b)。给予非转导T细胞的小鼠表现出持续的肿瘤进展，而给予两种培养系统产生的CAR - T细胞的小鼠在CAR - T细胞治疗后的第4天至第21天表现出快速的肿瘤消退，随后是肿瘤生长。在肿瘤控制方面，微生物反应器和透气井CAR - T细胞之间没有统计学差异(图6c - e)。这些数据表明，在微生物反应器中制备的患者来源的CAR - T细胞在体内的肿瘤杀伤功能与在透气井中制备的CAR - T细胞一样。我们还评估了由健康供体制成的CAR - T细胞的体内功能活性，同样观察到与未转导的对照组相比，给予CAR - T细胞的小鼠存活率显着增加，微生物反应器和透气井CAR - T细胞之间的存活率无统计学差异(扩展数据图7a,b)。随着时间的推移，与透气井CAR -t治疗组相比，微生物反应器CAR -t治疗组的肿瘤复发率趋于更高，尽管由于微生物反应器CAR -t治疗组的小鼠间差异很大，因此没有统计学差异(扩展数据图7c e)。这些数据表明，CAR - T细胞可以在2毫升体积的小微流控芯片中以高细胞密度制造，其体外和体内功能与在现有培养系统中以常规细胞密度生产的CAR - T细胞相当。
3：原文链接
https://doi.org/10.1038/s41551-024-01219-1
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