摘要:重组生物制药蛋白，如生长因子和抗体，通常在微生物或哺乳动物细胞中生产。然而，微生物宿主细胞无法生产需要明确寡聚化或特定糖基化谱的复杂生物制药蛋白，哺乳动物细胞不适合生产有毒蛋白。这些问题可以通过植物细胞培养来轻松克服，因为植物细胞具有进行复杂蛋白质修饰所需的机制，并且可以在亚细胞结构中隔离有毒蛋白。在本章中，我们首先比较了植物细胞培养和传统表达系统的特点，包括植物细胞生产复杂和/或有毒蛋白的能力。我们讨论了植物细胞和整个植物的主要优势，包括高通量瞬时表达，以快速、低成本的方式反映上游生产的简便性，用于快速、低成本的流程开发。然后，我们阐述了植物分子农业上游生产和下游处理阶段的当前挑战和趋势。最后，我们讨论了如何将这些不同的元素结合成一个基于植物的集成制造设施，以及这可能如何与传统生产平台不同。
1.介绍
重组蛋白由于在生物技术和生物制药行业的重要性，仍然是研究的重点。自1982年胰岛素作为首个在大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）中生产的重组生物制药蛋白获得批准以来，后者的年增长率一直保持在10-15%。这种持续的增长之所以可能，是因为制造过程中的瓶颈不断被克服。例如，1986年单克隆抗体（mAbs）作为一种新型产品类别的出现，导致了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为生物制药行业主导表达系统之一的发展。CHO细胞解决了E. coli和其他细菌无法折叠和修饰复杂蛋白的问题，允许形成多个二硫键和添加糖基，同时提供了一个高效的分泌系统。
更近地，2020年SARS-CoV-2大流行显著加速了基于核苷酸的药物的发展，特别是用于疫苗接种。这些产品比基于蛋白的对应物更容易修改，允许针对新病原体变种的疫苗快速开发和制造。这引发了关于未来基于核苷酸的药物与基于蛋白的产品的好处的讨论。然而，这样的比较侧重于速度和适应性，而没有充分考虑功能性。例如，mRNA疫苗可以针对特定类型的细胞，并触发非毒性蛋白的合成，而癌症治疗可能需要以时间限制、靶向和局部化的方式生产有毒药物，最小化系统性的非靶向效应，这在使用核酸基治疗药物时更具挑战性甚至不可能。抗体-药物偶联物（ADCs）是抗体与高度有毒的小分子药物共价结合，用于癌症治疗，这些药物不能由人类细胞合成。因此，基于核苷酸的药物也不适合此类应用。ADCs可以被重组免疫毒素（RITs）替代，其中有毒组分也是蛋白，并且与抗体翻译融合。理论上，这些结构可以作为核酸酸交付，但目前尚不清楚如何在不严重损害生产细胞和周围细胞群的情况下，在患者体内自体方式生产这些有毒蛋白。因此，重组蛋白对于这类应用仍然至关重要。重要的是，RITs和其他有毒蛋白不能直接在CHO细胞中生产，因为它们对宿主细胞的有害影响将严重限制最终的滴度。因此，需要替代的表达系统来生产这些类别的重组蛋白。正如CHO细胞已经取代了细菌用于新型mAbs的生产，植物和植物细胞培养（PCCs）更适合生产有毒产品，反映了植物细胞的额外分隔化、不同的信号通路，以及许多在哺乳动物中有毒的蛋白的靶标缺失。安全性、速度和可持续性是植物细胞的额外好处。重要的是，生物制药蛋白可以在植物和PCCs中生产，并且符合良好生产规范（GMP），如mAbs、疫苗和酶替代疗法所示。
在本章中，我们将简要概述植物制造药物（PMPs）的好处，然后讨论工业生产的当前挑战。鉴于大多数工业生产能力基于生物反应器，我们将专注于PCCs，因为它们与此设备兼容，但整体植物基础生产在其他地方有所涵盖。我们首先讨论植物细胞生产复杂蛋白的能力，然后考虑传统生物反应器中上游生产（USP）的挑战以及可能需要解决当前不足的发展。接下来，我们考虑下游处理（DSP）选项，它们如何与已建立的平台流程匹配，以及机制和混合建模的好处。最后，我们将这些方面结合起来，确定植物分子农业的当前状态与将其转化为“植物分子制造”可能需要的之间的差距。
2.植物和PCCs在分子农业中的优势和机会
在安全性、可扩展性、速度和可持续性方面，植物中重组蛋白生产的优势已经被广泛讨论。在这里，我们从产品的角度关注优势，特别是植物细胞为特定类别蛋白的制造商提供的机会。
2.1.在植物中表达毒素和其他复杂的生物制药蛋白
植物可以表达在哺乳动物或细菌细胞中表达时有毒的蛋白，因为有毒蛋白的分子靶标可能在植物中不存在，即使存在，有毒蛋白也可以被隔离在亚细胞隔室中，如液泡，这将产品与其靶标分离。例如，核糖体失活蛋白（RIPs）可以杀死哺乳动物细胞，但可以安全地在植物中生产。这在凝集素viscumin中得到了证明，它在澳大利亚烟草（Nicotiana benthamiana）中生产，纯化后的产量约为7 mg kg^-1鲜重（FM）。植物来源的蛋白大约是在同一细菌中表达的蛋白活性的三倍，可能是因为后者没有添加对第二类RIPs有效内化和细胞内运输所必需的糖基结构。
核糖体失活蛋白（RIPs）也已被与抗体融合，作为癌症治疗的候选药物，在植物中成功生产。在植物细胞中生产的首个RIT是与来自野葛（Bryonia dioica）的I型RIP布赖奥丁1（bryodin 1）融合的单链片段变量（scFv）抗体。更多的例子包括在生菜（Lactuca sativa）中表达的假单胞菌外毒素A的截短版本，以及在转基因烟草（Nicotiana tabacum）中生产的scFv-RC-RNase融合蛋白，产量约为2 mg kg^-1 FM，该蛋白旨在治疗肝细胞癌。尽管还没有植物制造的RITs完成临床开发，但工业兴趣日益增长。例如，比利时初创公司ATB Therapeutics1正在开发植物中的抗体-毒素融合蛋白，用于治疗难以治疗和难治性癌症。
植物分子农业的另一个有前景的产品类别来源于植物病毒，包括不含核酸的植物病毒样颗粒（VLPs），以及保留核酸的植物病毒纳米颗粒（VNPs）。这些产品基于植物病毒的衣壳，这些衣壳由多个相同外壳蛋白或不同外壳蛋白亚基自发组装而成。由于植物病毒已进化到在植物中复制和组装，异源VLPs和VNPs在烟草细胞中高效组装。VLPs和VNPs可以用作成像试剂、免疫调节剂、疫苗和抗癌治疗。
另一种可以在植物中生产的复杂蛋白是蜘蛛丝，当一个或多个被称为spidroins的多肽组装成螺旋结构时形成。这些产品因其非凡的韧性和弹性，在纳米技术和生物医学中具有价值。Spidroins可用于基于纳米粒子的药物传递，以及用于制备用于伤口愈合和组织再生的水凝胶或3D组织植入物。这些应用已经在动物模型中得到验证。重组spidroins可以在转基因植物如水稻（Oryza sativa）和苜蓿（Medicago sativa）中生产，这些植物比E. coli或哺乳动物细胞更适合工业规模生产。
同样，胶原三螺旋在植物中也容易生产。植物源性胶原目前由CollPlant Biotechnologies2在市场上销售，用于再生和美容医学应用，重组蛋白纤维具有高度的生物相容性。寡聚丁酰胆碱酯酶（BChE），用作生物清除剂，用于清除农药和化学战剂中存在的神经毒性有机磷化合物，是另一个更适合在植物中生产而不是哺乳动物细胞的蛋白的例子。与哺乳动物细胞主要产生不活跃的单体和二聚体BChE不同，植物细胞中形成了活跃的四聚体BChE。
2.2.生产具有工程糖基化的生物制药蛋白
植物还为治疗性糖蛋白提供了独特的制造优势。在真核生物中最常见的翻译后修饰（PTMs）之一是N-糖基化，但这在细菌中不常见。在真核生物和细菌中产生的糖基在结构上是不同的，并且在细菌中实现人源化糖基化谱是具有挑战性的。相比之下，在CHO细胞中生产的蛋白质的糖基化谱具有与人类糖基相似的（尽管不完全相同）N-糖基和O-糖基，因此CHO细胞受到青睐用于糖蛋白的制造，目前占批准的生物制药蛋白的60%以上。即便如此，CHO细胞中形成的非人糖基结构有时对人的制造有更相关的影响，并且不总是可以通过改变细胞培养条件进行微调。例如，CHO细胞生产的人类促红细胞生成素（EPO）高达80%被丢弃，因为非人糖基化模式干扰了其在治疗贫血过程中的生物活性。
植物糖基与人类糖蛋白上的糖基也不同，但这可能是有利的。例如，用于治疗高雪氏病（一种溶酶体储存障碍）的重组人类β-葡萄糖脑苷脂酶，在植物中表达并定向积累在液泡中是活跃的，因为这样会在糖基上添加甘露糖尖端，这些甘露糖尖端被人类巨噬细胞上的受体识别，相比之下，CHO细胞会延伸糖基并使蛋白失活，除非糖基在体外被修剪。同样，一些植物衍生的抗体已被证明比在CHO细胞中表达的相同蛋白的免疫原性更低，效力更高。
当糖基结构对重组蛋白活性至关重要时，可以对生产宿主进行基因改造，以利于产生合适的糖基化谱。这可以包括过表达或抑制个别酶，如唾液酸转移酶或唾液酸酶。这种精确策略已被用于改善在植物中生产的EPO的糖基化谱。基因工程甚至可以实现植物衍生糖蛋白的完全人源化，这可能支持批准糖基强烈影响药代动力学（例如，血清半衰期）或免疫原性的生物制药蛋白。植物通常不会在N-糖基化中的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）残基上添加末端唾液酸，这种修饰通常在人类中发现。然而，它们确实添加了核心α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖，这些在哺乳动物中找不到，因此需要几种修改来“人源化”植物糖基化机制。通过过表达缺失酶和使用RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9等工具抑制不需要的反应等策略，已经实现了这些修改。
2.3.构建工程植物系作为生物制药生产的平台
尽管像烟草植物这样的生产宿主并不与食品或饲料作物竞争，但它们含有有毒代谢物，如尼古丁碱，这些必须在下游处理（DSP）中去除以符合GMP法规[11]。通过使用CRISPR/Cas9技术废除尼古丁的合成，可以在不需要额外步骤去除该代谢物的情况下纯化重组蛋白。通过选择性敲除编码黄连素桥酶样（BBL）蛋白的六个烟草基因，阻断了尼古丁合成途径中的最终氧化步骤，导致尼古丁水平降低了99%以上。
对宿主植物的进一步改造可以增加产品产量，包括tRNA库的改造、抑制基因沉默或蛋白降解，以及优化应激耐受性。其他选项包括降低内源性氧化酶和蛋白酶活性，或共表达分子伴侣以改善蛋白折叠。
2.4.使用植物细胞生产复杂生物制药蛋白的瓶颈
尽管基于植物的表达平台可以生产复杂的生物制药蛋白，但与传统的微生物和哺乳动物系统相比，植物细胞的竞争力目前受到以下挑战的限制：(1) 上游生产（USP）产量，(2) DSP回收，以及(3) 与传统系统在技术上的差异，这些传统系统是为微生物和哺乳动物细胞设计的。
一个主要挑战是PCCs的产量相对较低，通常在10-100 mg L^-1的范围内，相当于1-15 mg L^-1 d^-1的生产力。PCCs中报告的最高产量约为1 g L^-1或约0.2 g L^-1 d^-1。这在微生物和哺乳动物细胞中实现的产量低端，通常在5-20 g L^-1或0.3-1.7 g L^-1 d^-1的范围内，并且可以达到50 g L^-1或4.2 g L^-1 d^-1。与整个植物不同，PCCs通常不需要复杂的澄清过程，因为产品可以分泌到培养基中并从中回收，类似于使用哺乳动物细胞的灌注过程，例如基于切向流过滤（TFF）或交替切向流过滤（ATF）。如果不具备基于亲和性的分离步骤，色谱纯化可能具有挑战性，对于非抗体产品通常是这种情况。
最后，业界对新型植物基表达系统的接受度和投资意愿有限。从分子农业社区内部看，阻碍广泛市场渗透的障碍可能包括低生产力、高DSP成本和监管障碍，但从外部看，可能仅仅是对技术的无知以及缺乏大规模生产基础设施。
3.植物制造药物：从小规模筛选到大规模生产
3.1.瞬时表达系统评估生物制药候选药物的可制造性
如果能够快速、小规模、高通量筛选（HTS）工具来评估不同的产品候选者，生物制药开发可以加快。最初，候选者筛选仅依赖于整个植物的瞬时表达。该系统基于农杆菌（最近更名为根瘤菌放射菌）及其自然能力，将转移DNA（T-DNA）从居民质粒动员并转运到植物细胞中。T-DNA可以被修改以携带任何感兴趣的基因，在细菌注射或渗透后的3-5天内将在植物细胞中表达，通常进入叶片。瞬时表达有几种不同的载体系统，包括基于双生病毒超转录的病毒复制子、magnICON平台和TRBO，以及pEAQ超翻译系统。重组蛋白的产量可以达到6 g kg^-1 FM。瞬时表达避免了转基因植物的选择时间（约6个月），因此在1周内提供了有用数量的目标蛋白。然而，瞬时表达通常对环境条件的变化敏感，导致批次间差异很大。
在叶片切片中筛选重组蛋白生产实现了更一致表达的第一步，但在96孔板格式中开发植物细胞包（PCPs）已大大提高了瞬时表达数据的通量和可比性。PCPs是多孔的植物细胞团，被塑造成不同容器的形状，便于瞬时表达和重组蛋白生产以可扩展的方式进行。通过在96孔板中浇铸PCPs，每天可以筛选至少2000个构建变体，包括那些带有不同启动子、非翻译区（UTRs）和靶向信号的变体，每个样本的成本约为0.5欧元。蛋白表达通常在3-5天内实现，产量可达到2.5 g kg^-1。重要的是，PCPs可以从不同细胞系中浇铸，规模从50-100 mg到200-300 g FM不等，允许它们用于筛选和生产用于初始活性/功能性评估的蛋白。在这种情况下，PCPs也可以用于快速且成本效益高的同位素标记蛋白，用于核磁共振光谱学和随后的结构阐明，这对于无法在哺乳动物或微生物系统中生产的复杂蛋白尤其重要。
PCPs中的表达水平通常与完整植物中的瞬时表达有很好的相关性，这有助于随着产品和流程的成熟进行放大。与完整植物中的瞬时表达相比，PCPs还具有更高的封闭水平，这是处理有毒产品和转基因生物（GMOs）时的重要安全措施。PCCs的一致环境还克服了影响整个植物的季节性变化，例如夏季光照高峰和叶片温度降低，这些都会降低夏季的产品产量。这些效应可能是蛋白质特异性的，因为一些报告显示冬季的产品产量较低。
因此，PCCs和兼容的筛选技术增加了在生物制药早期开发过程中可以测试和优化的候选者数量，并可以促进放大到完整植物的表达，如果需要这种规模的话。然而，为了使这项技术不仅用于筛选，还用于制造，必须提高PCCs中的表达水平。
3.2.植物细胞培养用于生物制药的生产
目前，与完整植物相比，PCCs的工业使用似乎更有优势，因为后者需要独特的设施，如温室或垂直农业单元（VFUs）。胡萝卜（Daucus carota）、水稻（Oryza sativa）和烟草（Nicotiana tabacum）细胞系已被用于生物制药的生产，因为这些细胞（i）实现了0.03-0.04 h^-1的增长率（μmax），与0.02-0.05 h^-1的哺乳动物细胞相当，（ii）可以被培养到600 g L^-1 FM的高细胞密度，以及（iii）含有少量非毒性次级代谢物。然而，当前的主要瓶颈是蛋白质积累低，我们在下面考虑一些克服这一问题的策略。
3.2.1.为植物细胞培养量身定制生物反应器设计和操作
大多数增加植物细胞中蛋白质积累的策略都集中在优化培养条件和蛋白表达上。搅拌罐（生物）反应器（STRs）通常用于植物细胞的培养，因为它们能够实现批处理、补料批处理、半连续和连续发酵制度，培养体积通常在50到100,000 L之间。然而，STRs通常为微生物或哺乳动物细胞设计，因此设计和培养条件可能不适合植物细胞。例如，植物细胞的体积明显大于细菌（~1 μm）、酵母（5-10 μm）或哺乳动物细胞（10-20 μm），使用最佳叶轮类型和配置（例如，Rushton、变螺距叶片或海洋型）以及最佳曝气策略可能不足以解决这些差异。在STRs中培养丝状真菌时克服类似问题的方法可能适用于PCCs。这包括处理PCCs高粘度和高细胞密度>100 g L^-1时的非牛顿流变学，这可能导致反应器中细胞分布不均，影响氧气和营养物质的供应。
流程优化也可以使用计算流体动力学（CFD）模型来实现，这些模型在许多微生物和哺乳动物细胞系统中都有应用。然而，当前的CFD模型通常将培养基视为一个由气体和液体相组成的两相系统，细胞均匀分布在液体相中。由于植物细胞的体积和大小较大，这种假设可能不合适。植物细胞的行为更像是固体颗粒，因此需要被视为一个三相系统中的固体相，正如最近建模的那样。这样的三相CFD模型可以通过数值模拟、大涡模拟（LES）或雷诺平均纳维-斯托克斯（RANS）和格子玻尔兹曼方法（LBM）模型创建，但这些目前需要超级计算机。因此，需要低阶模型来实现三相CFD模型的实施。
细胞分布还受到生物反应器中泡沫化的影响，高达75%的细胞生物质在泡沫中积累。泡沫由细胞外多糖、脂肪酸和分泌的植物蛋白引起，泡沫的严重程度取决于生物反应器设置、通气率和培养基的组成。为了减少泡沫化，通常对PCCs使用高速涡旋海洋叶轮，因为下行流使泡沫在液相中淹没和分散。然而，这可能会导致致命的剪切应力。例如，将搅拌器尖端速度从2.4提高到7.7 m s^-1，烟草细胞的生长减少了两倍以上。
值得注意的是，PCCs的典型通气率是0.1-0.4容器体积每分钟（vvm），但PCCs的氧气需求小于微生物和哺乳动物细胞，这表明可以降低通气率至0.1 vvm以下，甚至降至0.01 vvm，这也将限制泡沫的形成。同样，无泡培养可以防止泡沫化，并且可以通过在分散器中集成透气膜来实现。这种方法的可行性已在几项研究中得到证明，即使在高细胞密度>500 g L^-1 FM时，细胞生长也不受影响。
通过使用抗泡剂也可以减轻泡沫，尽管这类添加剂会将气体到液体相的氧传递率（OTR）和液体相到细胞内的氧吸收率（OUR）降低高达80%。因此，只有在泡沫影响生物反应器的无菌性时，才会在微生物和哺乳动物细胞系统中添加抗泡剂。对于高密度的PCCs发酵，其中通气率不能降低（或者降低可能无效），可以直接向培养基中添加抗泡剂。细胞培养中有多种类型的抗泡剂可供选择，其中基于聚丙二醇的Pluronics，如L-61、F-68和F-127，已经以0.01-0.05%的浓度用于烟草、胡萝卜和水稻细胞。最后，可以利用特定的光照条件来调节中间代谢物水平和植物细胞生长。由于两者都依赖于蛋白质，因此也依赖于酶的活性和丰度，光照也可能被用来在未来提高PMP表达水平。然而，光生物反应器的成本可能会高于传统对应物，因此这种额外的努力必须与潜在增加的产品产量相平衡。
3.2.2.通过培养基优化提高细胞生长和产量
对于植物细胞，有几种最小培养基可用，如Murashige和Skoog、Linsmaier和Skoog、Gamborg的B5、Schenk和Hildebrandt的SH和Chu N6培养基 （表8.1）。这些培养基包含碳源（通常是蔗糖）、硝酸铵和硝酸钾作为氮源，以及磷酸二氢钾和磷酸氢二钾作为磷源。还包括几种矿物盐、维生素和植物激素/生长调节剂。需要碳源是因为二氧化碳同化作用被植物激素2,4-D抑制，通常为此目的包含蔗糖，浓度为87 mM（30 g L^-1），这似乎对细胞生长是最佳的。例如，将87 mM蔗糖替换为197 mM葡萄糖或甘露醇分别降低了烟草细胞的生长和FM积累约20%和80%。这可能反映了更高的渗透压，导致渗透胁迫抑制细胞生长。在水稻细胞培养中，87 mM蔗糖可以被80 mM丙酮酸、80 mM乙二酸和氨基酸组合（10 mM甘氨酸、60 mM谷氨酰胺、20 mM天冬氨酸和13 mM精氨酸）替代，但这并没有提高细胞生长，而其他碳源如80 mM甘露醇、80 mM甘油和80 mM乳酸则降低了细胞生长。同样，胡萝卜细胞悬浮培养能够以甘油作为唯一的碳源生长。这些效应可能反映了培养基的不同渗透压或不同数量的碳可用（例如，相同浓度的蔗糖和葡萄糖产生不同数量的碳，因为蔗糖有六个碳原子，而葡萄糖只有三个）。在改变碳源时，必须考虑这两个方面。适度的渗透压和充足的碳源最好通过使用分批培养作为PCCs的默认策略来实现，尽管浓密的分批培养、灌注或连续培养可能表现得更好。虽然碳源对细胞生长有适度的影响，但氮源的影响要深远得多（表8.1）。
标准MS培养基含有18.8 mM硝酸钾和20.6 mM铵硝酸盐，相当于20.6 mM铵和39.4 mM硝酸盐，因此比例为1.00:0.52。Linsmaier和Skoog培养基也是如此，它针对烟草细胞的培养进行了优化。然而，其他培养基的铵含量要低得多，包括Gamborg的B5培养基（24.7 mM硝酸钾，1.0 mM硫酸铵=铵/硝酸盐比例为1.00:0.08），SH培养基（24.7 mM硝酸钾，2.6 mM磷酸二氢铵=铵/硝酸盐比例为1.00:0.11），和Chu N6培养基（28.0 mM硝酸钾，3.5 mM硫酸铵=铵/硝酸盐比例为1.00:0.25）。这是因为较高的铵浓度可能有毒，并且还会抑制硝酸盐的吸收。在铵/硝酸盐比例的系统研究中，发现标准MS培养基促进了BY-2细胞的最佳生长，尽管其他人报告说更高的铵水平更能增加这些细胞的生长（18.8 mM硝酸钾，20.6 mM铵硝酸盐，20 mM氯化铵=铵/硝酸盐比例为1.00:1.03）。当硝酸盐水平提高时，烟草细胞的生长率下降了30%（18.8 mM硝酸钾，20.6 mM铵硝酸盐，100 mM硝酸钾=铵/硝酸盐比例为1.00:0.15），但这导致产品积累（重组抗体2G12）增加了17倍，从0.7 mg增加到12.0 mg L^-1 。尽管铵似乎对悬浮BY-2细胞的生长有有益的影响，但使用铵作为唯一的氮源（20 mM氯化铵）则没有生长。此外，已经表明向培养基中添加所有蛋白质氨基酸可以增加重组蛋白产量，如mAb所示，从15增加到45 mg kg^-1 FM，增加了三倍。值得注意的是，通常用于水稻细胞悬浮培养的AA培养基缺乏专门的铵和硝酸盐源，而是依赖氨基酸作为氮源：即1.0 mM甘氨酸，6.0 mM谷氨酰胺，2.0 mM天冬氨酸和1.54 mM精氨酸。假设氨基酸可以减少水稻细胞聚集的倾向。因此，合理优化最小培养基中的铵、硝酸盐和氨基酸组分有潜力提高细胞生长和产品形成。由于硝酸盐促进细胞生长和生物质形成，铵促进重组蛋白的表达，PCCs可以在两种不同的培养基中生长，第一种是生长培养基，第二种是诱导培养基。后者可以作为脉冲喂养在收获前添加。然而，另一种策略是半连续发酵水稻细胞，然后通过用不含蔗糖的诱导培养基替换含蔗糖的培养基来诱导蛋白表达。
磷酸二氢盐被用作所有培养基中的磷源（表8.1）。标准MS培养基含有2.7 mM磷酸二氢钾，相比之下，Gamborg的B5培养基中有1.1 mM磷酸二氢钠，SH培养基中有2.6 mM磷酸二氢钠，Chu N6培养基中有2.9 mM磷酸二氢钾。将MS培养基中的磷酸浓度从2.7增加到10.0 mM，生物质积累增加了五倍，从10%增加到50%的细胞包装体积（PCV）（从30增加到240 g L^-1），重组抗体2G12的产量也增加了约10倍，从2增加到19 mg L^-1。因此，提高培养基中的磷酸浓度或单独作为饲料添加可以改善生长和产品形成。在这种情况下，可以使用单独的磷酸饲料来调节培养基中的磷酸浓度，从而控制细胞生长和生物质形成，以及相应的收获时间。矿物质盐和维生素对烟草BY-2细胞的生长至关重要，但增加它们的浓度没有任何有益效果。在植物激素/生长调节剂的情况下，可以使用不同类型的生长素，如2,4-D、1-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚-3-丁酸（IBA），有时与细胞分裂素如激动素或6-苄基腺嘌呤（BAP）和赤霉素（GA）结合使用，在培养基中以相等的浓度。生长素对BY-2细胞的生长至关重要，但生长素的类型并不重要，添加细胞分裂素和赤霉素没有明显效果。
3.2.3.通过脱钩生长和产品形成来提高生物质和蛋白产量
植物细胞生长和重组蛋白表达的脱钩确保所有资源最初都用于支持细胞生长和生物质形成，然后在达到高细胞密度时切换到产品形成。如上所述，瞬时表达在完整植物中脱钩了生长和产品形成，PCP格式在PCCs中实现了相同的策略。然而，PCPs的可扩展性目前有限，需要大量的细胞处理用于PCP铸造和渗透。这些限制不适用于稳定转化的PCCs，在大规模生产中因此应用了其他手段来在时间上脱钩生长和产品形成。一种脱钩策略是用可诱导的启动子替换组成型启动子。这在微生物系统中已经广泛应用，如大肠杆菌中的IPTG可诱导表达和酵母中的甲醇可诱导表达。植物中有各种可诱导的启动子（表8.2），其中在PCCs中已经测试过的有水稻α-淀粉酶3D（RAmy3D）、地塞米松（DEX）、四环素（TetA）和氧化应激诱导的过氧化物酶（POD）启动子，以及原生质体中的红光可诱导启动子。然而，只有RAmy3D系统在产量上取得了显著的改进，将其从10-100提高到100-250 mg L^-1。RAmy3D启动子由蔗糖饥饿诱导，通常通过将含蔗糖的生长培养基与不含蔗糖的诱导培养基交换来实现，以便在定义的时间点开始基因表达。然而，这种培养基交换可能会增加工艺成本。除了Ramy3D启动子外，还在整个植物中测试了各种可诱导的启动子系统，并可能适用于PCCs。根据诱导刺激是物理的还是化学的，将这些系统分为两组。第一组的成员通常（但不一定）来自植物，而第二组的成员可以来自植物、微生物或动物。物理可诱导启动子由非生物因素激活，如氧气可用性、温度、干旱和光。水稻Os.hb2启动子和拟南芥（Arabidopsis thaliana）Adh启动子分别由提高的CO2水平（30%）和O2耗尽上调。拟南芥HSP18.1启动子和大麦（Hordeum vulgare）同源物HvHSP17由热休克（37-40°C，1-2小时）诱导，而由硬质小麦（Triticum durum）和水稻的冷诱导TdCor39和OsWRKY71启动子以及拟南芥的rd29启动子则通过将整个植物暴露在4°C下4小时来诱导。大麦HvDhn4s启动子由干旱诱导。最后，拟南芥PhyB启动子在红光（660 nm）下活跃，但在烟草原生质体和苔藓Physcomitrella patens下的远红光（740 nm）下不活跃。来自细菌Thermus thermophilus的CarH/CarO启动子由绿光（525 nm）诱导，并已在拟南芥原生质体中证明是功能性的。
化学诱导启动子由化学试剂或底物的存在或缺失来调节。如上所述，一个来自植物的相关例子是水稻RAmy3D启动子，由蔗糖饥饿诱导。其他直接由应激激素激活，如脱落酸（ABA），它影响上述冷诱导启动子，或水杨酸（SA）及其类似物苯并噻二唑-7-羧酸S-甲基酯（BTH），刺激烟草PR-1α启动子。其他化学诱导系统由一个嵌合转录因子和一个来自异源的同源启动子组成。诱导剂结合到转录因子上，使其结合或释放其目标启动子片段，该片段可能与规范的植物启动子如CaMV 35 s融合。这些启动子可以由抗生素、类固醇、杀虫剂、乙醇或铜诱导，它们在分化的整个植物中的活性已被证明。最常见的抗生素调节启动子来源于大肠杆菌，基于四环素类似物（TetR/TetA系统）或克拉霉素（E/ETR系统）的结合，而由链霉菌产生的青霉素刺激的PIP/pPIRON启动子系统。
类固醇诱导型启动子包括基于啮齿动物地塞米松（DEX）盒的各种系统（GR/GVG、GR/LhG4 和 GAL4/UAS），以及在烟草、拟南芥和玉米中已证实活性的由雌二醇诱导的人类XVE/LexA系统。然而，使用这些系统获得的蛋白产量低于使用组成型启动子所获得的产量。针对昆虫的蜕皮激素激动剂类杀虫剂（如muristerone、methoxyfenozide或tebufenozide/EcR）开发的农药调节启动子，源自烟草夜蛾（Heliothis virescens）、云杉夜蛾（Choristoneura fumiferana）和欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis），已在烟草和拟南芥或玉米中进行了测试。基于玉米中的安全剂Sa5/In2-2的除草剂诱导型启动子，但需要抗磺酰脲类植物。酿酒酵母中的铜诱导启动子（ACE1/MT）在烟草（Nicotiana tabacum）中使用，但铜的毒性会降低其效果。另一种普遍的化学诱导型启动子是来自曲霉菌（Aspergillus nidulans）的乙醇诱导型AlcR/AlcA系统，该系统最初在烟草中建立，然后转移到其他植物种类。乙醇系统已在转基因植物和瞬时表达系统中使用。哪些诱导系统可以转移到PCCs尚待观察，但从理论上讲它们都应该有效，特别是对于表达有毒蛋白如水醇注射毒素（RITs）非常有用，如上所述。
4.下游处理的趋势
4.1.从培养上清中收获和产品回收
在植物分子农业中，药品的下游处理（DSP）常被确定为主要成本驱动因素。然而，DSP也是哺乳动物细胞中单克隆抗体（mAb）生产的成本驱动因素。此外，许多先前的瓶颈，如过滤能力和宿主细胞蛋白（HCPs）的高浓度，最近已被克服。重要的是，这些DSP挑战在完整植物中更为突出甚至独有，而不是PCCs。例如，植物细胞有助于将重组蛋白分泌到培养基中，从而可以轻松地从培养基中分离出蛋白，无需立即收获或破坏细胞，类似于哺乳动物细胞培养中使用的ATF/TFF等灌注技术，并且已经证明对水稻细胞有效。如果从STR中直接分离分泌型产品不切实际，或者如果产品在植物细胞中以提高稳定性，则适用于微藻脱水的TFF和絮凝组合适用于从培养上清中收获细胞。絮凝剂的使用可以改善植物提取物的澄清，但在设计后续纯化步骤时必须小心，因为带电的絮凝剂可以不可逆地结合并阻塞与相反电荷的色谱树脂。基于倾斜板沉降器或离心机的（加速）沉降步骤也可用于回收植物细胞或将其与培养基分离。由于植物细胞的大尺寸（约100微米直径），沉淀是在更温和的条件下实现的，如4000 g下5分钟，与微生物的7500 g下35分钟相比，因此过程设备的技术要求不那么苛刻和昂贵。离心机也可用于随后的澄清。
4.2.细胞内产品回收和澄清的提取
植物细胞裂解是必需的，以回收细胞内产品。为此目的有几种机械、化学和酶促方法可用，并且可以组合以提高效率。尽管这些过程选项中的许多是为微生物细胞开发的，但它们已适应PCCs的要求。例如，高压匀浆机或珠磨机可用于水稻细胞的裂解。植物细胞通常比细菌具有更厚的壁，但植物细胞的大尺寸（约100微米直径）使它们更容易受到机械裂解。如果机械裂解效率不高，可以选择包括纤维素酶预处理步骤，以降低植物细胞壁的刚性。然而，这些酶必须符合质量标准（例如，食品级或药品级），从而增加成本，并且在随后的DSP步骤中必须去除这些酶。无论产品是细胞内的还是分泌的，通常都需要一个或多个澄清步骤进行固液分离，因为细胞碎片会从基于TFF的收获中带入。如上所述，离心可以作为初始澄清步骤，例如使用盘式堆叠离心机。如果可以使用相同的离心机进行不同阶段的过程，如细胞回收和固液分离，这是特别有吸引力的。盘式堆叠离心机可以半连续或连续操作，并能实现植物细胞沉降所需的力。然而，它们的操作成本很高，手动清洗劳动强度大，特别是在GMP条件下。此外，离心通常不足以实现后续纯化步骤中涉及色谱所需的大约50 nephelometric turbidity units (NTU)的浑浊度。因此，离心通常与深层过滤结合使用。这增加了过程复杂性（包括库存保管），但如果固液分离完全基于使用相同辅助泵和平衡的所有过滤器，可以简化。与离心不同，目标蛋白与设备之间几乎没有相互作用，常见的过滤组件如硅藻土可能会结合到目标蛋白上，降低回收百分比。
改变诸如pH值和电导率等工艺条件可能有助于减少这些相互作用，或者可以使用不含硅藻土的过滤器，但后者可能会降低过滤性能，例如将滤液的浑浊度增加到约1500 NTU，而含硅藻土的过滤器仅为3 NTU。传统的深层过滤器不允许细胞回收，因此将限制在含有分泌产物的工艺流程中使用，而正压或真空鼓过滤器有助于进一步处理收集的生物质。重要的是，最近开发了集成过滤器，允许细胞捕获、裂解和产品洗脱，从而大大简化了初级产品回收。最终，澄清策略的选择将取决于分离问题（例如，待去除的产品和胶体之间的大小和密度差异），产品属性（例如，与过滤材料的结合）和工艺规模（例如，设备的可用性）。因此，应为每个单独的进料流确定这些参数，然后将其用作合理工艺开发的输入。
4.3.非色谱纯化
生物制药蛋白的纯度必须足够高以确保患者安全。色谱法是实验室和工业过程中生物制药纯化和抛光的关键技术，因为可以轻松实现>95%的纯度。不幸的是，色谱工艺条件的高材料成本和耗时优化是生物制药产品开发和制造过程中的主要成本驱动因素，而大量的宿主细胞蛋白（HCPs）可能会使植物源性哺乳动物蛋白（PMPs）的问题更加复杂。因此，简单、可扩展、非色谱的操作作为初始步骤以实现纯化是吸引人的，特别是当这些步骤可以通过将它们应用于多个产品并进行最小的工艺调整来“平台化”时。
可以通过热处理或低pH值诱导HCPs的沉淀，这已经成为一种针对完整植物的平台方法。相同的方法可以应用于PCCs的处理，PCCs包含同一物种完整植物中发现的HCPs的一个子集。通常，可以在一个步骤中去除超过60%的HCPs，例如加热至60°C或将pH值降低至4.0，使用可扩展的设备如换热器。热处理和低pH处理甚至可以结合使用以适应对任一参数极端敏感的目标蛋白。
如果由于产品敏感性不能使用热处理或pH值来去除HCPs，基于尺寸的分离通过超滤/透析已被证明是一种成功的替代方法。由于许多植物HCPs形成寡聚体，它们的有效尺寸通常>100 kDa。因此，可以使用30、70或100 kDa的膜，有时甚至300 kDa，来分离HCPs和产品，如cyanovirin N、ferritin和butyrylcholinesterase所示。可以进行连续操作，但是浓度极化甚至膜污染可能会降低这种基于膜的分离操作的性能，因此需要实施适当的过滤材料、模块设计和控制策略，例如使用拉曼显微光谱。基于膜的纯化还有一个额外的好处，即可以设计膜级联以促进纯化和浓缩，因此首先去除生物过程中最丰富的杂质，即水。这已经应用于植物源性重组蛋白，并且可以快速适应基于PCC的过程。水相两相系统（ATPS）是具有前景的无色谱纯化方法，它们集成了固液分离、浓缩和纯化。这种方法已经应用于植物源性重组蛋白如mAbs，但需要进行广泛的筛选以确定合适的条件，以形成具有理想分布系数（通常>10）的两相，因此技术可能难以平台化。目前，非色谱纯化步骤通常无法实现>95%的产品纯度，色谱法因此仍然是纯化和抛光的主要方法。
4.4.色谱纯化
色谱法利用液体相中的胶体（例如蛋白质）与固定树脂之间的选择性相互作用。树脂通常用配体功能化以改善和/或改变这种选择性，这也取决于产品属性（例如，尺寸和表面电荷分布）以及工艺条件，如pH值、电导率和接触时间。因此，优化色谱纯化是一个多参数问题，在很大程度上取决于产品。很难提供通用的纯化策略建议，本章的范围不包括色谱的详细讨论。
一种通用的方法是使用高通量方法结合统计实验来确定合适的工艺条件和纯化序列 。简化纯化的一个途径是使用具有选择性配体的亲和色谱，例如使用Protein A捕获抗体。然而，必须为目标提供合适的蛋白质域进行亲和纯化。缺乏天然配体可以通过表达带有附加亲和标签的目标来克服，例如N末端或C末端His6序列。然而，这些标签在最终产品中持续存在，并引起包括意外的免疫原性在内的监管问题。因此，已经开发了可切割的标签，可以在初始亲和捕获步骤后去除。这一代标签通常会留下一个或多个氨基酸附着在目标蛋白上，因为切割位点在标签内。最近，设计了第二代可切割标签，可以精确切割，使目标蛋白保持原始状态。然而，这些新技术通常受到知识产权的保护，因此它们的使用将伴随着许可成本。
4.5.色谱模型可以减少下游工艺开发和监管审批时间
尽管在不同重组蛋白产品之间可以进行某些知识转移，但大多数优化步骤是特定于产品的。在DSP开发中，一个在学术界和工业界越来越受到重视的趋势是色谱建模。基于物理化学原理的机理模型可以对色谱柱内的蛋白质分离进行先验预测。机理模型由描述质量传递和蛋白质吸附到给定色谱固相（例如离子交换树脂）的方程式组成。它们必须用经验数据进行校准，数据集的大小取决于模型的复杂性。如果数据集有限，可以简化模型（例如，通过集中质量传递参数）以降低过拟合的风险。最近的一项研究表明，与经验过程表征相比，机理模型可以将实验工作量减少约75%，如mAb纯化步骤所示。此外，这些模型可以直接用作数字孪生，以促进模型预测控制。这与欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）提出的持续最佳性能概念非常吻合。
机理模型可以由数据驱动的方法补充或增强，产生所谓的混合模型，这些模型对于色谱纯化工艺的早期开发特别有用，当进料通常对于机理描述过于复杂时。例如，最近的一项研究描述了使用定量结构-活性关系（QSAR）模型对不同色谱树脂上抗体Fab片段的预测，通过使用不同产品变体库生成训练数据集。这种方法可以大大减少工艺开发时间，并可能成为未来色谱步骤开发的重要工具。关于建立这种建模方法的详细指南最近已经发布。
5.将植物分子农业转变为植物分子制造
在本章中，我们已经展示了PCCs对于生产需要翻译后修饰（如糖基化和二硫键）的复杂且可能有毒的重组蛋白具有优势。尽管在完整植物中积累重组蛋白方面取得了实质性进展，但该系统在理论上是可扩展的，但目前缺乏全球生产能力，特别是在GMP背景下。相比之下，PCCs与现有的发酵基础设施基本兼容，并且有快速筛选工具可用，但由于产品产量低，植物细胞在STRs中的表现目前不如微生物系统和哺乳动物细胞培养。因此，我们认为，将植物分子农业（在植物中生产重组蛋白和代谢物）推进到“植物分子制造”，我们在这里定义为以成本效益高、经济可行和可扩展的方式生产这些产品，首先需要将PCCs适应现有的全球制造基础设施（STRs），一旦行业和监管机构对该平台建立了理解和信任，就可以探索在完整植物中生产的额外好处和机会。为此，建立可以作为瞬时和稳定表达平台的遗传定制植物细胞系将非常重要。定义的、高性能培养基的合理开发以及相应的培养策略（例如，反应器操作、进料制度和诱导产物形成）应该与此活动齐头并进。最后，DSP操作应进一步针对PCCs的要求进行调整，包括通过鼓过滤器进行细胞分离以及相应的小规模模型和设备。一旦这些改进到位，植物、植物细胞和植物分子制造就可以补充现有的宿主系统，用于生产新型生物制药，并有助于促进未来全球、民主和可持续的高质量药品获取。
