摘要:人间充质干细胞（hMSCs）是用于细胞治疗应用中最为突出的细胞类型之一。当前的临床研究越来越关注从脐带等组织中分离得到的年轻hMSCs，因为它们展现出独特的治疗特性。为了它们的治疗应用，需要一个复杂的生产过程来产生高质量且数量充足的hMSCs，以满足治疗需求。这要求根据质量由设计（QbD）原则进行过程开发，以获得强大的过程知识。化学定义培养基（CDM）是获得过程稳定性并满足良好生产规范（GMP）和过程分析技术（PAT）要求的关键组成部分。另一个因素是采用先进的过程模式，这些模式实施了在线过程控制以稳定过程结果。在本章中，我们讨论了脐带hMSCs的使用及其生产过程，重点关注细胞扩增、化学定义培养基的使用、实验设计（DoE）方法用于过程开发以及强化的生物反应器过程。
1.引言
人间充质干细胞（hMSCs）最初是从骨髓中分离出来的。今天我们已经知道，除了骨髓（BM），hMSCs还存在于许多人体组织中，例如脂肪组织（AD）、脐带血（UC）或脐带基质、肝脏、牙髓、人类胎盘和月经血。尽管有关hMSCs分化潜能的冲突结果被报道，但它们通常被认为是多能性的，并且能够在体外分化为间充质系的组织。根据供体的年龄、性别、健康状况以及组织来源，hMSCs表现出不同的特征。来自受损患者的hMSCs可能难以适应现有的体外扩增协议。此外，根据它们的组织来源，hMSCs在生长速率、表面标记表达、分化潜能和免疫调节能力方面也有所不同。脂肪组织来源的hMSCs比骨髓来源的hMSCs增殖更快，而年轻的脐带来源的hMSCs比成人hMSCs增殖更快。整合素的表达对于细胞外基质连接和粘附至关重要，不同组织来源的hMSCs之间整合素的表达也有所不同。即使是来自同一组织来源但不同供体的hMSCs，也显示出不同的生长性能。此外，体外培养条件，例如在不同的培养基中扩增，也会影响免疫抑制和粘附相关分子的表达。hMSCs是一个对微环境变化敏感的异质性细胞池。为了产生可靠的hMSC药物产品，一个定义明确、理解透彻且稳健的生物反应器生产过程是先决条件。hMSCs是细胞治疗应用中最有前景的细胞类型之一。临床治疗通常集中在免疫调节性hMSCs上，它们要么是从患者体内分离出的自体细胞，用于个性化治疗，要么是从另一个个体分离出的同种异体细胞。后一种选择为治疗影响大量患者的疾病提供了可能性。截至2023年，clinicaltrial.gov确定了大约298项基于hMSC的临床试验，这些试验要么已完成，要么已终止，正在进行中，或者正在全球招募中。这些案例主要集中在美国、欧洲和中国。hMSC临床试验至少需要约20×10^6个细胞，治疗剂量通常包含2-3×10^6 MSCs/kg。通常需要根据治疗适应症重复给药。临床试验和传统治疗所需的细胞数量将很高，因此体外扩增是强制性的，因为自然发生的hMSCs只占体内总细胞数量的一小部分。
尽管一些公司，如Osiris Therapeutics（使用同种异体骨髓MSCs治疗GvHD的Prochymal）在产品3期试验中报告了一些失败，但全球市场上已有获批的基于hMSC的产品，并且正在开发中（表13.1），这强调了大规模生产hMSCs的重要性。hMSCs被归类为先进治疗药物产品（ATMP），其生产受到许多法规和指南的约束。在生产过程中必须非常谨慎，以生产出最高质量的细胞。必须根据良好生产规范（GMP）指南仔细控制、调节和检查过程的每一步。
2.从废物到奇迹：利用脐带hMSCs为治疗应用提供动力
在hMSCs中，特别是从脐带中分离出的细胞可能比其他细胞具有更有利的治疗益处。英国医生和解剖学家Thomas Wharton首次发现并描述了脐带基质（即Wharton's jelly）。Wharton's jelly（WJ）内的细胞群包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞和hMSCs，它们具有独特的产前和产后基质细胞特性的组合。脐带hMSCs因其丰富性而受到关注，与骨髓hMSCs相比，收集骨髓hMSCs的过程是侵入性和痛苦的。脐带hMSCs可以轻松获得，没有伦理问题，因为胚外组织通常在出生后被丢弃，同时仍然展现出年轻细胞所需的特性。此外，从脐带组织中分离出的hMSCs数量通常高于从其他来源获得的数量。脐带hMSCs还显示出有希望的增殖性能，表明它们与成人hMSCs相比相对原始的性质，因为已经证明了成人hMSCs的年龄与生长潜力之间的负相关性。脐带MSCs已被证明比从其他来源衍生的hMSCs引起更低的免疫反应。这使它们成为细胞治疗中更安全、更有效的选择。
脐带作为干细胞来源的概念始于1974年，当时首次从脐带血中提取出祖细胞和造血干细胞。在这一发现之前，剩余的脐带组织被视为医疗废物。然而，脐带作为hMSC来源的发现则是后来的事情，McElreavey等人描述了来自Wharton's jelly的成纤维细胞样细胞，Wang等人确认Wharton's jelly-hMSCs表达基质受体（CD44, CD105）和整合素标记（CD29, CD51），但不表达造血系标记（CD34, CD45）。UC-hMSCs的起源仍有争议，有两种假设，一种认为胎儿hMSC在胚胎发育期间迁移和定植，另一种认为脐带形成时就存在原始hMSC。
对于细胞分离，无菌脐带在出生后12-24小时内收集和处理。外植体/出芽法[25]利用hMSCs固有的粘附于塑料表面和从外植体迁移的能力。去除血管和上皮后，将Wharton's jelly解剖成小块放入6孔板中，并加入培养基。随着时间的推移，UC-hMSCs会自发迁移并定居在孔板的塑料表面上。或者，将Wharton's jelly块与酶混合物（例如胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶）在37°C下孵化30分钟至16小时。得到的悬浮液被过滤、洗涤和离心，剩余的细胞被培养。最近，开发了一种新技术，结合了酶消化和机械分散。在酶消化后，混合物被机械均质化，使细胞提取产量增加了160倍。为确保hMSCs适用于临床试验，细胞培养基必须是无血清的，分离程序应涉及最小的组织处理，并且时间更短，典型的处理时间为每个脐带3到4小时。
UC-hMSCs的治疗应用主要集中在两个不同的领域：组织工程和细胞治疗（表13.2）。对于组织工程，UC-hMSCs在骨骼再生方面特别有效，如软骨的发展，以及在皮肤和角膜再生等其他领域的应用。在细胞治疗方法中，移植的hMSCs可以通过两种机制起作用：（i）通过激活组织特异性干细胞的内在分化和hMSCs分泌的细胞因子和生长因子的特性来再生病理组织，或（ii）通过hMSCs的免疫调节特性介导的炎症反应。2006年，Weiss等人将UC-hMSCs移植到患有偏侧帕金森病的免疫抑制大鼠的大脑中。治疗显示了在阿朴吗啡诱导的旋转中有所改善，这是帕金森病模型的标准测试。同年，Conconi等人研究了将UC-hMSCs注射到受损的骨骼肌中，通过自发地分化为肌源性谱系来支持肌肉再生过程。2007年，Friedman等人展示了使用UC-hMSCs作为移植辅助剂的潜力。2011年，Peng等人确定UC-hMSCs作为神经组织工程的有前景的细胞来源，因为它们能够分化为Schwan细胞谱系。根据国际细胞治疗学会（ISCT）的指导方针，UC-hMSCs能够在体外分化为各种细胞类型，包括软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、类肝细胞、皮肤成纤维细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、类牙细胞、骨骼肌细胞、产生胰岛素的细胞、内皮细胞和多巴胺能神经元。然而，hMSCs是否也在体内表现出这些分化特性是一个有争议的领域。UC-hMSCs的可塑性受到妊娠条件的影响，研究表明，来自先兆子痫患者的UC-hMSCs，这种情况的特点是高血压和尿液中过多的蛋白质，表现出对神经胶质分化的增加倾向。从妊娠糖尿病的患者获得的UC-hMSCs被观察到细胞生长减少，细胞衰老提前，脂肪生成和成骨分化潜力降低，线粒体活性降低。此外，从早产妊娠中获得的UC-hMSCs已被证明与从足月妊娠中衍生的细胞相比，其成骨潜力降低。分泌特性和因此分泌的广泛生物活性化合物是hMSCs独特的治疗特征。对来自不同来源的hMSCs的蛋白质组和转录组的定量评估突出了共享特征。UC-hMSCs分泌许多参与过程的因子，如血管生成（例如，CXCL-1, CXCL, CXCL-5, CXCL-6和CXCL-8），血管生成（通过表达CXCL-2, MDK, EGF和FGF-9的基因），神经元迁移（HBEGF, MDK, EGF）和神经突起的生长（NTF-3, MDK）。此外，UC-hMSCs能够分泌细胞因子和造血因子，包括G-CSF, GM-CSF, LIF, IL-1, IL-6, IL-8和IL-11，使它们成为造血干细胞扩增的合适选择。此外，UC-hMSCs能够在分化为成熟的类胰岛细胞团后，对生理葡萄糖水平做出反应，分泌特定因子，如人类胰岛素。UC-hMSCs能够分泌与BM-hMSCs相似的细胞因子。此外，UC-hMSCs能够分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF），这促进了白细胞的增殖。这在化疗、骨髓移植或治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）方面具有治疗意义。UC-hMSCs主要用于同种异体移植，它们的低免疫原性是一个关键要求。它们表达低水平的人类白细胞抗原I类（HLA-I），这保护它们免受自然杀伤细胞介导的溶解。此外，UC-hMSCs不表达HLA-II和共刺激抗原，如CD80和CD86，这些抗原涉及T细胞和B细胞反应的激活。因此，UC-hMSCs抑制刺激的淋巴细胞的增殖，并且具有降低的免疫原性。T淋巴细胞通过分泌INF-γ和TNF-α，是在同种异体情况下的主要免疫反应元素。
2.1.确定hMSC产品的关键质量属性（CQAs）的质量目标产品概况（QTPP）
hMSCs的异质性及其与微环境的复杂相互作用在从实验室规模实验过渡到工业生物制造过程时带来了重大挑战。为了克服这一挑战并确保一致和标准化的生产过程，hMSC扩增应基于质量由设计（QbD）原则进行开发。QbD是一种科学和基于风险的产品开发方法，目前在制药行业蓬勃发展。这一原则整合了生物学和工程学的科学知识，并为通过风险分析的质量保证提供了合理的框架。QbD过程（图13.1）首先明确定义质量目标产品概况（QTPP），概述了期望的产品质量特征。QTPP包括关键质量属性（CQAs），这些属性规定了产品的物质、化学和生物属性。因此，CQAs，例如每个hMSC产品的身份、效力、无菌性、纯度和安全性受到严格控制，但因个体hMSC产品及其预期的治疗应用而异，不能从一个产品转移到另一个产品。
身份：由于缺少独特的hMSC标记而具有挑战性
通过形态学和表型分析确定hMSC的身份，然而不同组织的hMSCs在表型表面标记和基因表达水平上有所不同。这些组织来源依赖的差异主要是由于特定细胞生态位施加的环境条件变化（例如，氧气水平、组织刚度）所致。如前所述，供体年龄和健康状况进一步影响hMSC特征。由于hMSC缺乏用于可靠识别的独特表面标记，研究人员依赖于表面标记的组合和表型特征。各种社团和研究所已经概述了hMSC特征。ISCT在他们的“定义多能间充质干细胞的最低标准”中提供了MSCs的定义。这个定义根据它们的表面标记（cluster-of-differentiation）指定了细胞的身份，这些标记应该表现出阳性表达（>95%）的CD105、CD73、CD90，另外还有CD166和阴性表达（<2%）的CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA类II。ISCT定义中的其他标准包括在标准条件下体外培养时粘附于塑料表面，以及在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。这些特征必须根据其来源为每个hMSC系确定和定制。基因表达水平影响蛋白质转录和表面标记表达，这直接影响hMSC的表征。尽管讨论仍在进行中，自然发生和/或体外培养的hMSCs的确切表型仍然不清楚。使用针对Syndecan-2（CD362）和基质前体抗原-1（STRO-1）的抗体可以丰富特定的hMSC亚群，通过选择具有所需属性的细胞，例如增加的免疫调节能力或增强的再生潜力，从而增强这些细胞的治疗潜力。
hMSCs的CQA可以是其集落形成单位（CFU-F）的频率。CFU-F测定涉及每10平方厘米的培养皿播种100-500个细胞，并允许在14天内形成集落，然后用结晶紫染色以可视化和计数集落。典型的CFU-F值范围为AT-hMSC的15%到25%，BM-hMSC的22%到38%，UC-hMSCs的22%到30%。
效力：从活性和分化能力到分泌组分析——可量化指标，预测临床应用的治疗效力
hMSCs的效力通常取决于产品预期的治疗适应症。虽然有多种效力测定方法可用，但只有特定的测定方法适用于个体hMSC产品。例如，分化效力测定仅适用于基于组织形成的治疗机制发展的hMSCs。由于它们的机械敏感性，MSCs的分化过程可能受到各种环境条件的显著影响，包括剪切应力和氧气浓度。因此，hMSCs的效力测试应该是特定的、准确的、稳健的和合适的，具有明确的接受和拒绝标准，纳入相关标准和控制，并产生定量数据，以确保在不同实验室获得的结果可以准确比较和分析。效力是一个可测量的属性，作为生产一致性的重要指标。在hMSC生产过程中，重要的是要在每个步骤，如分离、扩增、收获和澄清以及最终配方后监测细胞活性、代谢活性和增长率。活性是效力的潜在指标，因为只有活细胞才能作为治疗单位。为了进行这种监测，使用流式细胞术等技术进行活性测试和细胞计数，包括染料排除。各种染料用于区分有效和无效的细胞，甚至在封装配方中。如果治疗目标是细胞植入或组织形成，测量分化潜力的测定可能适合描述hMSC效力。为了遵守FDA法规，需要定量的生物测定来测量效力。如前所述，一种标准方法是在分化培养基中体外分化MSCs 21天，然后进行测试。然而，非定量染色分化标记可能不够，替代方法如分化后RNA/蛋白分析，或通过拉曼光谱学在线监测分化可能更合适。
未分化状态的hMSCs分泌各种因子，这些因子具有免疫调节、抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗菌特性，并促进血管生成。如果hMSCs的治疗效力是通过其分泌的因子介导的，那么细胞的分化潜力可能不是它们效力的主要决定因素。ISCT推荐使用包括定量RNA分析评估选定基因产物、流式细胞术检测功能相关的表面标记，以及基于蛋白质的测定法来绘制hMSC的分泌物并确定它们的免疫调节效力。使用先进的蛋白质组学和物理化学技术，如多重酶联免疫吸附测定（ELISA）或质谱，来识别和定量hMSC的分泌物，提高对这些细胞治疗潜力的理解。为了进一步表征hMSC的分泌物并评估它们的免疫调节特性，开发了体外功能测定。这些测定可以直接或间接测量hMSCs的活性，更适合评估它们的效力。有多种效力测定方法可用，但选择适用于个体hMSC产品的特定测定至关重要。
测量吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）活性可能提供对hMSCs免疫调节活性的见解。IDO是色氨酸分解的初始和限速酶，色氨酸是一种促进T细胞活性的氨基酸，转化为L-犬尿氨酸。通过这一机制，IDO已被确定为hMSC介导的抑制T细胞增殖的关键因素。此外，划痕或迁移测定是一种广泛使用的技术，用于测量细胞的迁移能力。在体内，细胞迁移在伤口愈合中起着关键作用，细胞被吸引到损伤部位，它们分化为专门的细胞类型，并分泌细胞因子和趋化因子以支持受损组织的再生。体外，这一过程可以通过在细胞密集层中创建一个“划痕”或间隙，然后用hMSCs或它们产生的分泌物处理来模拟。随后监测划痕的内生长或闭合情况，作为处理细胞迁移和再生潜力的指标。例如，混合淋巴细胞反应（MLR）也是一些hMSC产品的适当测定。MLR利用hMSCs抑制T细胞增殖的能力。这种抑制在体内通过两条途径发生。第一条途径涉及通过Fas/Fas配体途径促进T细胞凋亡。具体来说，hMSCs表达Fas配体，而T细胞表达Fas受体。两者的结合诱导T细胞凋亡，有效地消除它们。第二条途径涉及hMSCs释放诸如B7-H4、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和血红素加氧酶-1（HO-1）等因子。这些因子诱导T细胞周期停滞，它们的释放可以通过用TNF-α和IFN-γ刺激MSCs进一步增强。在体内，存在一种调节机制，以防止过度抑制T细胞，这可能导致对破坏免疫系统的病原体的易感性。
这些测定可以帮助确定hMSCs对免疫细胞的影响，提供对它们作用机制的见解，并有助于开发标准化和验证的hMSCs测定方法。但由于它们的变异性，从这些测定中获得稳健和准确的结果具有挑战性。然而，在动物模型或基于细胞的测定可以用来确定相关因素的限制之前，建立分泌物剖面和体内效力之间的明确联系至关重要，因为这些作用方式在临床上是相关的。必须评估所有测试转移到体内条件的可转移性。要从复杂且高度可变的体内测定转移到多测定方法，研究人员可以使用包括活性量化、目标特异性细胞毒性或细胞因子释放、替代生物标志物（与功能相关的形态表型或释放因子）、生物活性（例如，表面标记的呈现）、基于细胞的测定，以及基因组、转录组和蛋白质组剖面在内的一系列技术组合。
无菌性、纯度和安全性：每个hMSC产品必须具备的。
hMSC产品的无菌性是一个关键方面，需要遵守严格的安全和纯度指南，以最小化意外物质、污染物和微生物感染的风险。杂质是在生产过程中产生的不需要的成分，如不需要的细胞类型、来自生产设备和材料的颗粒以及培养基的成分。另一方面，污染物来自外部来源，如细菌、真菌、病毒、内毒素和支原体。它们的微生物检查由欧洲药典（EuPh）第2.6.2、2.6.14和2.6.27章规定。纯度测试确认不存在残留过程试剂或细胞碎片等污染物，而安全性测试确保不存在微生物污染物和产品的无菌性。然而，传统的微生物学方法可能不适用于保质期有限的产品。因此，EuPh的微生物检查章节涵盖了替代测试。基于ELISA的测试通常用于确保不存在内毒素、残留蛋白质或其他污染物等不需要的生物制剂。多目标流式细胞术或基因芯片可以用来更好地表征产品的纯度。基因组筛查方法可用于检测hMSC产品中病毒、细菌或支原体的存在。由于产品由活细胞组成，因此不可能进行最终灭菌步骤，因此整个hMSC生产过程必须在无菌条件下进行。由于hMSCs是异质的，识别和消除不需要的细胞类型可能具有挑战性。理想情况下，hMSC制备应该是纯净的，但通常存在杂质，如成纤维细胞。为了实现足够的纯度，可以使用基于标记的细胞特异性排序，如在MSCs上表达水平更高的CD166和在成纤维细胞上表达水平更高的CD9。或者，如果最终产品中的大多数细胞（>98%）根据MSC表面标记的最低标准，可能被认为是足够的。应进行风险评估，以确定CQA列表上最有影响力的属性，基于它们的影响和确定性。目标是确保最终产品满足所需的规格，并实现其预期的治疗目的。
潜在的肿瘤发生性/恶性是治疗性人类间充质干细胞（hMSC）产品的一个安全问题。根据Prockop等人的研究，新鲜分离的原代hMSC变为肿瘤的概率极低，每次细胞分裂周期的频率低于10^-9。尽管如此，原代hMSC群体是异质的，某些参数可能会促进肿瘤发生，包括细胞培养条件、供体或不同年龄和分裂的细胞，例如在长期细胞扩增期间。虽然异常通常只会导致细胞衰老，但由于DNA损伤导致的细胞转化风险是难以消除的，这一过程在肿瘤形成中至关重要。2014年对92个临床级骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的研究显示，在86个案例中仅有3个出现克隆突变，而这些突变均未导致恶性转化或表型变化。为了排除异常细胞的可能性，可以采用G带核型分析和原位荧光杂交（FISH），正如欧洲药品管理局（EMA）细胞产品工作组（CPWP）和先进疗法委员会（CAT）所推荐的那样。如果未观察到染色体异常，则不需要对每个批次进行细胞遗传学测试作为放行标准。然而，在生产过程中对批次样本进行冷冻保存是有用的，以便在需要时进行未来测试。
2.2.通过定义关键过程参数（CPPs）增强hMSC制造
每个影响hMSC产品关键质量属性（CQA）的过程参数都是关键过程参数（CPP）。制造hMSC的每个过程步骤都有几个应控制的CPP。在体外扩增步骤中，CPP包括细胞密度和细胞年龄、原材料属性（如生长因子和培养基）以及培养容器或生物反应器系统的操作特征，如pH、温度、溶解氧和搅拌。必须在设计空间中量化每个CPP对CQA的影响（图13.1）。通过采用适当的控制策略，可以将CPP维持在其最佳操作范围内，从而确保生产出符合所有要求CQA的高质量hMSC。由于hMSC的复杂性和异质性，每个hMSC产品的CQA都是独特的，相应的CPP必须逐个案例识别。然而，根据生物反应器的设计，某些CPP可能难以获取。因此，了解不同CPP如何影响hMSC产品的CQA并相应优化制造过程至关重要。最终，遵循质量源于设计（QbD）原则和控制CPP对于确保hMSC产品的质量、安全性和有效性至关重要。在hMSC扩增过程中典型的CPP已在Barekzai等人中进行了回顾，并在此仅作总结：
• 细胞相关参数 形态、代谢行为、增殖速率、活性和接种细胞密度 细胞年龄、组织来源和供体变异性
• 生化参数——第3章中有更多讨论。代谢物：葡萄糖、离子、脂质、氨基酸和肽、维生素、微量元素和生长因子 分泌因子：激素、趋化因子和细胞因子
• 物理化学参数 溶解氧条件（例如，缺氧） 温度、pH和渗透压
• 设备相关参数——第4章中有更多讨论。生长表面和细胞外基质（ECM）组分：刚度、拓扑结构、整合素、涂层（10-20微米厚） 如糖胺聚糖（GAG）、胶原（COL）和纤维连接蛋白（FN）。反应器类型/几何形状：反应器设计（例如，STR dS/dT ≥ 0.4）、通气、静水压力、压缩、拉伸、剪切应力和搅拌。
• 下游处理（DSP）中的参数 收获、分离、澄清、浓缩、配方和储存。
与储存相关的CPP更多，因为新鲜细胞相比于冷冻保存的现成细胞具有更高的代谢适应性和增殖能力。然而，新鲜方法带来了后勤挑战，而冷冻保存可能对hMSC的活力、功能和体内持久性产生短期影响。尽管如此，吞噬细胞吞噬凋亡hMSC的理论表明，这可能解释hMSC介导的免疫抑制，使hMSC适应性概念的相关性降低。总体而言，提供最佳培养条件、避免细胞应激、监测干细胞质量和基因修饰，并确保适当储存是重要的。当采用现成的hMSC治疗方法时，使用不含异种污染物的冷冻保护剂配方是必需的，这些成分应为化学定义的，且不应包含二甲基亚硫酰胺（DMSO）。此外，这些冷冻保护剂应具备直接送达患者床边而无需进一步操作的能力。
3.寻找最佳hMSC扩增培养基：使用实验设计（DoE）方法的特征化和优化
选择最佳生长培养基及其他CPP是体外培养领域细胞培养技术的主要任务之一。毕竟，培养基作为能量来源，为细胞提供生存、增殖和维持细胞功能所需的所有成分。当前用于分离和扩增hMSC的细胞培养基配方包括胎牛血清（FCS）、人AB血清（ABS）或人血小板裂解液（PL）作为补充剂。然而，这些已建立的补充剂本质上是未明确定义的配方，含有多种生物活性分子，其组成在不同批次间变化，并且存在引入病原体（如病毒、朊病毒或其他逃避常规筛查程序的动物源性病原体）的风险。
在大多数情况下，使用的是含有缓冲系统的基础培养基，它已经包含了必需的氨基酸、盐、维生素和底物，如葡萄糖，在此基础上还会添加多达20%的胎牛血清（FCS），以提供各种生长和粘附因子、脂肪酸和脂质。除了引入hMSC过程中的病原体风险外，免疫原性牛蛋白的存在可能会引发不需要的免疫反应。FCS的成分变化很大，存在季节性和地理波动，这使得hMSC扩增过程的可复制性和标准化几乎不可能实现，后续的纯化也变得困难。此外，FCS不适合在GMP指南下用于生产指定为ATMPs的hMSC，因为必须保证没有动物材料的存在。因此，需要找到一种替代品或替代血清基础的hMSC扩增方法。分为四组：（i）无血清培养基，（ii）无蛋白培养基，（iii）无异种蛋白培养基，和（iv）化学定义培养基（CDM），在允许的补充产品上存在差异。在无血清培养基中，可以使用牛血清白蛋白等粗蛋白分数，而在无蛋白培养基中只能使用肽分数，即蛋白质的水解产物。在无异种蛋白培养基中，完全排除了动物成分，只允许使用如人血清白蛋白等添加剂。化学定义培养基的标准最严格，只允许精确定量的高纯度组分，如重组蛋白。然而，许多市售的hMSC培养基的组成并未披露，这意味着无法确保是否存在激素或更大的分子。这通常需要定制开发hMSC扩增培养基，通常基于市售的基础培养基，并添加各种生长和附着因子。最佳培养基的结果是由所选CQAs定义的hMSC最佳性能。
3.1.hMSC扩增的化学定义添加剂
已知不同的生长因子和添加剂对hMSC扩增至关重要（表13.4）。在某些情况下，已经特别讨论了单个生长因子的影响，但在其他情况下，已经测试了许多不同生长因子的完整配方，这使得无法对单个影响得出精确结论。
基本成纤维细胞生长因子（bFGF）具有促进增殖的特性，经常被提及。血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子-β（TGF-β1）也观察到积极效果。特别是，已经描述了这三种因素对骨髓-hMSC生长的正协同效应。诱导的信号通路在评估这些生长因子的影响时很重要。例如，PDGF和bFGF通过c-Jun N端激酶（JNK）信号通路诱导增殖。这条通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的成员，基于三步激酶级联。JNK是随后与最终效应因子c-Jun相互作用或磷酸化的激酶，c-Jun是转录因子AP-1的一个组成部分，因此干预了增殖，因为AP-1调节的基因参与了细胞分裂。TGF-β1通过细胞内蛋白Smad-3传递信号，促进增殖。TGF-β1的受体结合导致Smad-3的磷酸化，其在复合物形成后积累并转移到细胞核，从而激活或抑制下游基因。还建立了这条信号通路与Wnt信号通路之间的联系。在研究不同生长因子总体效应的出版物中，表皮生长因子（EGF）是提到的因素之一。Sabri等人表明EGF通过四个信号通路促进hMSC增殖。这些包括三个MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路。在PI3K-AKT通路中，EGF与酪氨酸激酶受体的结合激活了PI3激酶（磷脂酰肌醇3激酶），该激酶使细胞膜磷脂成分PIP2磷酸化为PIP3。PIP3然后与激酶PDK1和AKT结合，在最后一步中通过磷酸化参与增殖的蛋白质来控制增殖。其他与积极增殖效应相关的生长因子是胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和血管表皮生长因子（VEGF）。IGF-1是骨骼中最丰富的生长因子之一，根据Doorn等人的说法，也被认为是促增殖的。IGF-1促进增殖的信号通路尚不完全清楚，但在骨肉瘤细胞中，它已与ERK信号通路联系起来。这条MAPK通路的特点是生长因子与膜受体的结合，然后启动了一个三步激酶级联。最终激酶激活细胞核中参与增殖调控的细胞外信号调节激酶（ERK）1和2。对于VEGF，Kong等人也发现了与ERK信号通路的联系。然而，Hefka Blahnova等人没有发现VEGF对hMSC增殖的积极效应。同样，Collins等人得出结论，IGF-1并不促进hMSC群体的完全增殖。这种争议导致了需要开发一种特别适应特定hMSC类型的培养基。例如，hMSC的不同分离来源和组织结构可能是增殖效应差异的原因。此外，这种培养基必须针对其特定用途进行测试。例如，已经表明定制的无血清配方支持静态培养中的hMSC生长，但必须适应微载体的培养。
Forte等人表明，hMSCs短期暴露于肝细胞生长因子（HGF）可以激活相应的Met受体及其下游效应因子ERK1/2、p38MAPK和PI3K/Akt，而长期暴露于HGF则导致细胞骨架重组、细胞迁移，并通过在G1-S检查点的阻断显著抑制增殖。HGF的浓度依赖性效应进一步被描述为成骨分化介质（DM），其中低浓度的HGF（20 ng/ml）更倾向于通过增加c-Met表达和磷酸化、Akt通路激活以及p27、Runx2和Osterix的表达来促进MSC成骨分化。相比之下，高浓度的HGF（100 ng/ml）通过强烈激活ERK1/2信号通路强烈诱导增殖。在无血清培养基中，低浓度的HGF（10 ng/mL）增加了hMSCs的增殖和活性。
3.2.通过统计实验设计优化化学定义培养基以增强细胞增殖
转向使用化学定义培养基（CDM）并避免含有血清的复杂培养基，突出了独立优化培养基的必要性，以确保为不同类型的hMSCs提供精确和量身定制的供应。hMSCs的培养基开发是一个多方面的过程，需要微调各种相互作用的组分以支持最佳的细胞生长和效力。为了确定特定hMSCs及其微环境的这些组分的最佳组成和浓度，必须采用适当的实验设置。
传统的培养基开发方法是逐个因素（OFAT）实验。这包括一系列滴定，其中单一培养基组分被调整到最终浓度，而其他组分保持恒定。这种方法的一个问题是需要优化的大量因素，以完全优化特定hMSC类型的培养基。OFAT方法的另一个限制是它无法考虑不同组分和条件之间的相互作用。因此，即使进行了所有的OFAT实验，综合结果也可能无法确定理想的增殖和hMSC效力的最佳条件。
实验设计（DoE）是生物加工中用于细胞培养基开发和优化的成功且众所周知的工具。在生物加工中，采用顺序策略是有效的，首先筛选多个组分，然后表征变量之间的关系，最终进行优化。然而，在优化原代细胞的培养基时，由于供体变异性很高，DoE方法有时无法提供可靠的预测，并且必须用每个供体进行确认，或者必须进行微调。
一些研究已经使用DoE方法成功地分化造血干细胞并促进其扩增，但尚未发表有关DoE方法促进hMSCs增殖的具体数据。有关优化无血清培养基以促进小鼠胚胎干细胞生长的好的顺序方法已有报道。作者使用不同的设计模型研究了11种生长培养基因子的影响。他们首先采用分数因子筛选设计（分辨率IV）来识别11个因子的主要正面或负面效应。随后，使用全因子设计来识别可能的双向相互作用。最后，使用响应面模型（RSM）来充分了解浓度范围。研究发现，胰岛素和白血病抑制因子（LIF）对细胞生长有积极影响，而锌和半胱氨酸只有很小的影响。
对于筛选大量因素（如培养基优化）的方法，Plackett-Burman设计特别适用于在少量实验中识别主要效应，尽管它不允许调查因素之间的相互作用。它通常用作初始筛选步骤，以识别应进一步使用更复杂的实验设计进行调查的最重要因素，如响应面方法或因子设计。
另一种方法是分数因子筛选设计（分辨率IV），这也是一种DoE类型，用于高效筛选大量因素或变量，同时最小化所需的实验数量。在分数因子设计中，只测试所有可能的实验条件的一个子集，同时仍提供足够的信息来估计每个因素对感兴趣结果的影响。分辨率IV的分数因子设计涉及在两个水平上测试每个因素，并使用设计矩阵，以便每个因素在每个水平上至少测试两次。这允许估计主要效应和因素之间的双向相互作用，同时仍保持实验条件数量可管理。例如，具有五个因素的分辨率IV分数因子设计只需要16个实验条件，而全因子设计则需要32个条件。在筛选设计之一识别主要因素后，可以使用响应面模型（RSM）创建最终的数学模型。该模型可以优化因素和响应之间的复杂关系。在此模型中，可以选择不同的设计来定义设计空间，如中心复合设计（CCD）或面中心设计（FCD），以预测导致期望响应的最佳条件。RSM涉及将回归方程拟合到在输入变量的不同水平收集的实验数据，这些数据可以表示为3D空间中的一个表面。该表面可以可视化为等高线或3D图，响应作为z轴，输入变量作为x和y轴。RSM可以用来识别将导致响应变量最大或最小值的输入变量的最佳组合。它还可以帮助理解输入变量和响应之间的关系，包括任何相互作用或非线性效应的存在。总结DoE方法是媒体或过程优化的有力工具，特别是当涉及许多参数时，这些参数显示出复杂的相互作用。
4.连续生物反应器过程包括自动化和控制策略，以确保细胞治疗所需的适当数量的hMSCs
由于每剂需要大量的hMSCs，扩增过程必须非常高效。为此，唯一可行的选择是使用生物反应器的复杂动态过程。由于hMSC是一种严格粘附的细胞，必须在生物反应器设置中提供生长表面。提供生长表面的方式取决于生物反应器系统。有多种动态生物反应器用于扩增hMSCs，包括液力驱动和机械驱动系统（图13.2）。
4.1.各种生物反应器类型适用于hMSC扩增
液力驱动生物反应器利用泵产生动力，hMSCs可以在灌注的塑料表面（平行板生物反应器）、中空纤维或填充颗粒（固定床生物反应器）上生长。中空纤维生物反应器被认为是高细胞密度连续灌注培养系统，其中小管被放置在卡匣壳内，并将细胞培养基泵入其中。hMSCs生长在纤维外部或周围，这在小体积内提供了一个大面积。然而，一个主要挑战是有效的细胞脱落。中空纤维生物反应器和固定床生物反应器也已探索用于hMSC扩增（表13.5）。对于所有这些生物反应器，可以区分可重复使用和一次性系统。在固定床生物反应器中，细胞被固定或封装在圆柱形柱中填充的颗粒矩阵中，可能包括大孔珠、多孔陶瓷或玻璃珠、玻璃纤维、聚酯盘、藻酸盐珠或水凝胶。细胞培养基通过床层填充物温和地流向细胞，只对细胞施加低剪切力。固定床系统也已用于hMSC扩增，但可用的生长面积仍然有限。
机械驱动生物反应器，包括搅拌罐生物反应器（STR）、波混系统和旋转生物反应器，通常用于hMSC扩增。然而，旋转生物反应器主要用于组织工程而不是细胞扩增。这些系统通常与微载体（MC）技术结合使用，为hMSCs提供生长表面。MC已在工业和粘附连续细胞系培养过程中使用多年，以最大化细胞的附着表面。在粘附细胞培养中，必须找到足够的混合以悬浮微载体、足够的氧气转移和低水力应力以防止细胞损伤之间的微妙平衡。因此，研究人员提出了不同的搅拌器和搅拌速度选择，以实现颗粒的最佳悬浮，同时最小化细胞所经历的水力应力。尽管尚未为MC上的hMSCs建立统一的培养条件（浓度、协议、搅拌），但已进行过几次MC筛选。这些筛选通常在小规模动态系统中进行，如转瓶（表13.5）。带有搅拌器或磁性棒叶轮的转瓶在低搅拌下运行（30-100 rpm）。由于转瓶的工作体积有限（例如，80-250 mL），并且在基本配置中缺乏监测，因此不适合大规模hMSC生产。已进行了多次含有BM-hMSCs、AT-hMSCs或hMSC-TERT的转瓶培养，使用含血清或无血清培养基，平均过程时间为5-10天。因此，在无血清培养中的平均扩增因子要高得多（4-18），而在含FCS的培养基中为（2.5-8.4）。另一方面，使用UC-MSCs和FCS替代品如人血清的转瓶培养显示扩增因子为20.8，使用人血小板裂解液（HPL）为15，在无血清培养中为5至13。
在STR中比在转瓶中实现了更高的扩增因子（表13.5）。STR使用顶部或底部安装的旋转搅拌系统，根据不同的混合参数选择不同的叶轮，并且通常配备传感器以监测和控制各种参数，如温度、pH值、溶解氧（DO）、二氧化碳浓度、气体和液体流速以及叶轮或摇摆速度。温度可以精确监测和控制，例如，在37°C，pH值可以维持在7.2到7.4之间，hMSC培养更倾向于缺氧条件，DO值设置在空气饱和度的20%（纯O2的4%）。此外，扩增因子也因过程模式而异（表13.5）。STR允许高级过程模式和控制，包括珠对珠转移，能够在培养过程中从微载体上脱落并在分裂后附着到另一个微载体上，为基于MC的hMSC扩增过程的发展。
4.2.hMSC扩增的先进过程模式正在快速发展
传统上，hMSC培养是在1到10升的生物反应器中以批量模式进行，没有添加培养基或微载体（MC）。然而，由于营养物质迅速耗尽和缺乏可用的生长表面，UC-hMSC在批量模式下的培养仅持续几天。通过使用如分批补料或连续灌注等高级过程模式，可以提高批量培养的有限生产力。分批补料操作模式涉及随着细胞消耗底物，生物反应器的工作体积逐渐增加，并且可以使用不同的补料策略（例如，重复批量或脉冲式补料、固定、线性或指数增加的补料速率）进行。在生物反应器中hMSC培养的背景下，分批补料模式通常用于改善细胞在少量培养基中的粘附，然后逐渐增加培养基的体积。这允许持续供应营养物质，并有助于稀释细胞产生的有毒代谢物（例如，乳酸的临界浓度为34毫摩尔或氨-NH3为2.4毫摩尔）的浓度，从而提高细胞活性和生产力。在连续灌注过程中，细胞通常通过自旋过滤器或切向流过滤（TFF）方法保留在搅拌罐式生物反应器（STR）中，同时不断移除使用过的培养基。灌注STR的主要优点之一是能够精确控制培养基的补充和移除速率，每天可达几个反应器体积。相比之下，连续模式依赖于细胞生长动力学来确定这些速率。Serra等人在2010年描述了使用灌注搅拌罐式生物反应器扩增未分化的人类胚胎干细胞（hESC）。他们的实验使用了一个适配生物反应器盖的探针和自动称重介质灌注控制系统。这种方法允许更新营养物质和生长因子，以及移除代谢废物副产品。Dos Santos等人在STR中用BM-hMSC测试了灌注模式，应用了0.25天^-1的灌注速率，并保持了400毫升的工作体积。使用基于修改的交替切向流（ATF）系统（Repligen Corporation，马萨诸塞州，美国）的细胞装置保留系统，将hMSCs和MC保留在STR中，扩增因子达到18.5。最后，Cunha等人测试了一个切向流过滤（TFF）系统，以维持细胞和MC在STR中，这允许更高扩增细胞比例更长时间。需要注意的是，所有这些研究报告主要关注底物限制，而不是生长表面限制。然而，在化学定义的培养基中扩增hMSCs伴随着一些可能阻止最大细胞密度的CPP。这些包括hMSCs的细胞-细胞聚集、未占据的MC或活力丧失。一些出版物已经报告了补充MC的额外喂养，允许珠对珠转移，部分与25%的介质喂养策略相结合。这允许长期稳定的扩增，并可能控制聚集形成。只有在高细胞密度时才观察到聚集。间歇搅拌也可以使细胞在MC上均匀分布。减少培养开始时的表面积/体积比也常用于促进粘附。在化学定义的培养基中使用连续过程模式扩增hMSC尚未建立，并且仍有改进的空间。
4.3.实时监测对于连续生产控制至关重要
使用带有高级过程模式的STR是扩增治疗性hMSC的有前景的方法。STR的一个关键优点是能够实时监测温度、pH值和氧气水平等重要参数，这可以确保一定的过程稳定性。然而，尽管在线监测提供了有价值的数据，但hMSC扩增的许多CPP仍然依赖于离线测量以确保质量控制。由于FDA在2004年提出的过程分析技术（PAT）概念已得到其他主要监管机构的批准，如欧洲药品管理局（EMEA）和日本厚生劳动省（MHLW），因此需要先进的监测和控制工具。PAT的主要目标是降低生产成本，提高生物产量，确保实时产品放行，并提供常规过程审计。PAT涉及在生产过程中使用各种分析化学工具来监测和控制CPP。过程知识是PAT的一部分，但使用基于近红外、FTIR（MIR）、拉曼或介电光谱的在线分析传感器进行过程控制是关键元素，即使是高级过程模式也是如此。已经演示了使用基于光谱的技术，如紫外-可见光谱、荧光光谱、红外光谱、拉曼光谱和介电光谱进行细胞活性的在线监测。一些技术已经应用于MC上生长的hMSC。对于分批补料和连续过程，需要精确调节以确保最佳过程控制。大多数光谱传感器适用于连续过程监测，并提供有关过程的分子、物理和代谢状态的详细信息。由于它们不需要试剂或采样，因此是非侵入性的原位技术。软传感器，通常与生物信息学数据分析相结合，可以从同一组测量数据中估计多个生物学变量，除了活性之外。然而，大多数提出的传感器仍处于研究阶段，只有少数商业上可用。准确性、可重复性、选择性、灵敏度、鲁棒性和稳定性是软传感器为离线方法提供可靠替代品的挑战。因此，验证软传感器很重要。软传感器在维护更容易和获取成本更低方面比特殊传感器有优势。越来越多地，基于计算和人工智能的方法集中在设计能够更高效地生产功能性细胞和组织的自动化生物反应器上。一些最近的研究在这方面显示了有希望的结果。计算建模也被证明在提高临床级细胞产品的可预测性方面是有效的。这些生物加工技术的进步预计将提高hMSC基础疗法的可预测性和临床结果。
5.结论
为了在生物反应器中可靠地扩增hMSCs，必须解决多重挑战。这些挑战包括需要更好地理解影响hMSC生产的CPPs，以及改进实时监测工具来控制这些参数并测量它们对CQAs（如细胞活性、效力和分泌谱）的影响。为了满足GMP生产中PAT的要求，至关重要的是开发一个标准化的过程，该过程可以模仿自然的hMSC生态位，但也可以扩大规模用于临床试验，同时不牺牲诸如细胞功能和效力等CQAs。
hMSC疗法开发中仍存在的挑战之一是细胞质量的生产。虽然基于生物反应器的生产系统可以提高hMSC制造的可扩展性，但需要进一步提高细胞密度和生产力以满足临床试验的需求。由于hMSC对剪切力的敏感性以及它们在生物反应器培养中的聚集倾向，实现高细胞密度可能具有挑战性。此外，大规模生产受到hMSC在体外有限的增殖能力和它们随着分裂次数增加而倾向于不符合CQAs的限制。开发负担得起且化学定义的培养基，可以在不妥协其质量的情况下支持hMSCs的生长，这对于hMSC疗法的广泛采用至关重要。使用化学定义的培养基也有助于解决与动物源性补充剂使用相关的监管问题。
来自不同供体和组织的hMSCs的异质性，导致不同的表型和功能，也是制造的一个挑战，使得实现标准化和可复制的平台过程非常复杂。一方面，生物反应器中发展良好控制的体外扩增过程可以帮助减少hMSCs的批次间变异，确保细胞产品保持更加均匀。为了生产具有标准化特性的hMSCs，开发经过验证的功效测定方法对于不同实验室之间的比较至关重要。另一方面，基因修饰技术可以产生更均匀的hMSCs或通过小分子“启动”hMSCs，这些小分子可以外源性地增强它们的治疗功能。下一代hMSC疗法预计将包括复杂的ATMPs，可能包括细胞治疗产品、基因工程产品（病毒和/或非病毒载体）、组织工程产品（生物材料/支架）、组织架构技术（3D生物打印和脱细胞器官）和/或医疗设备的组合。尽管这是未来令人兴奋的前景，但由于它们的复杂性，在GMP、过程可扩展性和监管方面，这些方法将具有挑战性。
hMSC治疗的成功临床转化依赖于在生物反应器中对hMSC扩增的强大过程，以及对影响hMSC CQAs的CPPs的改进理解，以及准确的实时监测工具来控制这些CPPs，以创造良好控制的条件，减少批次间变异。
