摘要:再生医学领域包括多种治疗策略，包括基因治疗、细胞治疗和使用生物工程组织构建物。尽管涉及活细胞的再生医学在临床试验中显示出了有希望的结果，但在可复制细胞材料的制造方面仍存在挑战。间充质干细胞/基质细胞（MSCs）参与了超过一千项临床试验，用于治疗广泛的疾病，体外扩增MSCs在治疗结果中起着至关重要的作用。在本章中，我们讨论了体外MSCs培养的关键参数，如培养基组成、放大策略、在生理氧张力下的培养和三维培养。我们展示了这些参数如何影响细胞的生理和功能，并强调了培养条件对于在体外培养过程中保持这些细胞所有可能的原生功能的重要性。
1.引言
豚鼠骨髓中间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的分离首次由Friedenstein及其同事在1970年报道。最初被描述为具有自我更新和成骨能力的成纤维细胞样贴壁细胞，现在从不同的后天组织中分离出的MSCs代表了临床研究的一个重要领域。除了它们的增殖和分化能力外，MSCs还可以调节免疫细胞，促进新生血管形成，支持血管生成，并通过直接细胞-细胞接触、释放细胞因子以及分泌细胞外囊泡（EVs）来保护目标细胞免于凋亡。目前，全球有超过1450项临床试验涉及MSCs。然而，尽管在发现后的相对较长历史中，MSCs及其基于MSCs的产品的生产仍然是一个重大挑战。
对于细胞疗法而言，根据引入方式（动脉、静脉或肌肉内）和注射频率，必须有数百万细胞（在0.5至2×10^6细胞每公斤患者体重的范围内）才能达到最大的临床效果。为了生产临床相关的组织工程构建物，必须有数亿细胞可用。这意味着无论最终应用如何，MSCs必须首先在体外扩增。因此，MSCs的有效和经济扩增在它们在基于细胞的疗法和组织工程中的应用中起着至关重要的作用。尽管供体选择、细胞来源、分离协议、最终质量控制和植入策略也在治疗结果中起着重要作用，但在本章中我们将专注于细胞生产。MSCs生产的整个流程包括几个步骤：细胞分离和创建主细胞库、细胞扩增、细胞收获、纯化、培养基去除、配方和储存。有几种方法可以扩增MSCs用于临床应用：（1）在细胞培养瓶中的传统静态培养，（2）在微载体上的培养——静态和动态以及（3）在各种生物反应器中的动态培养。除了使用不同的培养平台外，还必须考虑进一步的生物过程相关因素，例如使用化学定义的培养基和无异种补充剂或在生理相关的氧浓度下培养。
一般来说，可以概述MSC大规模生产的四个最重要（也是最具挑战性）的方面。第一个方面是MSCs是锚定依赖性细胞，因此它们不能像悬浮细胞（例如，CHO细胞）那样在传统的摇瓶或搅拌罐反应器中培养。在这种情况下，使用了几种策略和方法进行过程放大，如下所述。第二个重要参数是细胞培养基的组成。基础细胞培养基为细胞提供能量来源，包含生理盐和pH组成，但缺乏粘附蛋白、生物信号因子用于细胞存活、生长和分化因子。因此，基础培养基通常用天然来源的血清补充。然而，广泛使用的牛血清中的异种蛋白可以被培养的细胞并入，并在细胞植入后引起免疫反应，即使是在自体应用中。此外，培养的细胞可以被各种已知和未知的病毒、支原体和朊病毒感染。此外，使用FCS引起了关于动物福利和其残酷生产方法的重大关注。因此，无异种替代品用于培养基补充正在被密集研究，也将在本章中讨论。第三个基本因素是在生理氧浓度下培养细胞。在体内，MSCs在比传统孵化器提供的21% O2更低的氧张力下生长和功能。根据消耗率和组织血管化，氧张力从非常低（不到1% O2）在关节软骨的深层区域变化到高达7.8% O2在脂肪组织中。这些数据表明，低氧张力代表了所谓的生理性缺氧或“生理缺氧”，并且有效的呼吸链功能在不同类型细胞的特定狭窄范围的氧细胞浓度内发生。生理性缺氧对MSCs的影响也在下文中讨论。MSCs生产的第四个挑战是在三维（3D）环境中可能的细胞扩增。与非生理性的二维（2D）培养相比，3D微环境允许通过不同类型的细胞-细胞接触（间隙连接、紧密连接等）和生物活性信号分子进行动态细胞间相互作用。在生理微环境中的细胞扩增提高了最终细胞产品的质量，就干细胞特性、趋化性、免疫调节特性和血管生成效果而言。尽管将MSCs作为细胞团扩增会改善细胞特性，但通过团簇解离进行细胞收获需要用更激进的蛋白酶处理，这反过来又可能影响细胞生理学，例如通过表面受体的蛋白水解。MSCs在3D系统中扩增的优点和缺点也将在本章中进行回顾。
2.细胞培养基组成的重要性
选择合适的培养基是间充质干细胞制造最重要和决定性的步骤之一。特别是在再生医学中使用MSCs时，必须在有限的时间内获得临床相关的细胞数量，同时不损失所有原始MSC功能（例如保留所有受体和粘附分子，以及产生细胞外囊泡、趋化因子、细胞因子和生长因子）。
为了在GMP合规条件下成功治疗和可重复地制造细胞，MSCs的扩增程序必须有效、安全且定义良好，并且必须开发和建立受控条件。然而，迄今为止，仍然缺乏通用标准化的体外扩增协议。这些培养协议至关重要，因为培养条件可能会影响MSCs的转录组、蛋白质组和细胞组织。因此，培养协议可能会影响移植后的MSC特性和行为。因此，选择适合的培养基对于体外培养至关重要，它代表了最佳细胞生长和最终细胞产品质量的最关键步骤之一。
传统的细胞培养基由基础培养基组成，包括各种氨基酸、维生素、无机盐和能量来源（葡萄糖和谷氨酰胺），以及作为生长因子、激素和结合因子来源的血清（图12.1）。除了提供营养外，培养基还有助于维持pH值和渗透压。培养基的要求可能因细胞类型而异，因此导致使用了大量的培养基组成。由于基础培养基中的每个组分都具有特定功能，因此仅选择基础培养基对MSCs的培养成功至关重要。
对于MSCs的临床应用，细胞扩增所需的时间被认为是限制因素。此外，多项研究已经证明长期培养对MSCs的迁移、增殖、分化和遗传稳定性有负面影响。使用高葡萄糖培养基，由于葡萄糖的易得性，可以实现快速细胞生长。然而，快速细胞扩增仍不能保证细胞产品质量。例如，Zhang等人和Parsch等人证明高葡萄糖浓度（高于1 g/L）可能导致细胞衰老以及端粒缩短和基因组不稳定性。对于人骨髓来源的间充质干细胞（hBM-MSCs），Sotiropoulou等人表明低葡萄糖最小必需培养基鹰牌改良配方（α-MEM）（1 g/L葡萄糖）比杜尔贝科改良鹰牌培养基（DMEM）（1-4.5 g/L葡萄糖）或伊斯科夫改良杜尔贝科培养基（IMDM）（4.5 g/L）是更有利的基础培养基。为了向细胞提供生物信号并确保最佳细胞生长，培养基中添加了培养基补充剂。作为培养基补充剂的血清被认为是细胞培养基最重要的组成部分之一，并作为许多对细胞功能至关重要的因素的来源。例如，血清为细胞提供基本营养和参与生长促进和特殊细胞功能（生长因子和激素）的分子，以及结合蛋白（例如白蛋白、转铁蛋白）和细胞粘附蛋白（例如纤维连接蛋白）。血清还提供支持细胞扩散的因子以及蛋白酶抑制剂、矿物质（例如Na^+、K^+、Zn^2+、Fe^2+）和微量元素。
最常见和广泛使用的细胞培养基补充剂是胎牛血清（FCS），也称为胎牛血清（FBS）。迄今为止，它仍然被广泛用作大多数细胞分离或扩增协议以及一些再生医学研究的培养基补充剂。尽管使用FCS存在各种缺点，但迄今为止没有广泛接受的FCS替代品。FCS的理想替代品应该确保组成良好定义、杂质水平尽可能降低、生产成本低、保质期长且易于获得。作为培养基补充剂的FCS替代品正在研究中，包括人血衍生物（例如人血清（HS）或人血小板裂解物（hPL））和化学定义的培养基。
2.1.传统培养基补充剂
50多年前，MSCs的首次分离和培养也标志着首次使用人血清和异种血清补充细胞的实验的开始。从那时起，从胎牛心脏血液中获得的FCS已成为细胞培养中建立的补充剂，并且仍然被用于大多数临床研究/细胞的分离和培养协议中，尽管它不再被认为是黄金标准。作为一种非常复杂的补充剂，它提供了细胞生长所必需的各种生长因子、粘附蛋白、结合和运输蛋白、维生素、氨基酸、碳水化合物和激素。此外，FCS几乎可以无限量生产，生产成本非常低，因此可以轻易获得。
每年为细胞培养实验室生产500,000至800,000 L的FCS，来自高达200万头小牛。血清直接从怀孕的屠宰牛的胎儿中通过心脏穿刺采集，无需麻醉。这种在伦理上备受争议的血清收集之所以被使用，是因为与成熟牛血相比，胎儿血液中生长因子的产量更高，抗体更少。尽管抗体滴度低，但牛异种化合物如蛋白质或多糖可以在培养过程中被细胞内化。因此，即使使用自体细胞，植入后也可能引起免疫反应。此外，牛暴露于环境因素和病原体，这些因素可以直接通过胎盘屏障传递给胎儿。基于此，FCS在人细胞培养中的使用可能导致污染物（例如真菌、支原体或内毒素）或由病毒、细菌或朊病毒引起的可传播传染病传播给患者。
除了伦理和免疫学问题外，大批量变异性可能显著影响细胞产品的质量，从而导致结果出现大的偏差。尽管多年来对FCS的应用和研究，迄今为止，尚无法识别所有组分或完全理解FCS对细胞生长的积极作用背后的分子机制。
基于这些多重问题，FCS的使用不再被推崇为MSC制造的黄金标准。其使用备受争议，不推荐用于临床应用。实际上，组织和监管指南（世界卫生组织（WHO）、良好生产规范（GMP）、欧洲药品管理局（EMA））强烈推荐使用无异种替代品，为再生医学（例如基于细胞的治疗、组织工程）开发安全和标准化的MSC制造和应用协议（例如，细胞治疗）。
人血衍生物，如HS或hPL，代表了一种可能的无异种成分替代品。由于其人类来源（通过健康捐赠者的静脉穿刺获得）以及相关的较低免疫排斥反应风险和人畜共患传染病风险，以及在各种研究中显示的对细胞扩增/增殖、分化和免疫表型的增强效应，HS已经被商业化并用作FCS的可能替代品。然而，由于其有限的可用性（从健康捐赠者的血液中获得）以及昂贵和复杂但不标准化的生产，HS的生产已经在下降。因此，HS不再被认为是FCS在临床应用中的有效替代品。然而，直到普遍的化学定义培养基被开发和商业化之前，有必要评估现有的FCS替代品。在可用的血液衍生物中，hPL已经成为FCS和HS的一个有希望的替代品，并且在过去四到五年中也变得更加商业化。
2.2.人血小板裂解物（hPL）
在普遍适用的化学定义培养基开发出来之前，hPL似乎是间充质干细胞制造的一个有前景的培养基补充剂。它是一个有效的替代品，在许多细胞培养领域的研究中比商业FCS提供了更好的结果。全球范围内，献血活动通过全血捐赠或通过单采捐赠收集纯血小板，用于输血目的，这些被用于生产人血小板浓缩物（PC）。PCs只有有限的保质期，三到七天，因此大量PCs被丢弃（多达20%生产的PCs没有输血）。然而，过期的PCs是安全的，适合作为制备hPL的原料，同时不影响任何随后的细胞培养。hPL可以通过各种方法（声波、溶剂/洗涤剂（S/D）处理或通过重复冻融周期）根据GMP指南从PCs中获得。
hPL是一种无细胞、富含蛋白质和生长因子的培养基补充剂，具有许多优点。血小板的储存颗粒含有许多生物活性物质，在溶解后释放到溶液中，从而影响用hPL补充培养基培养的细胞。在白蛋白、纤维蛋白原（1–3 mg/mL）中，hPL中的调节蛋白和因子有多种细胞因子（例如，表皮生长因子（EGF）、基本成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、血小板衍生生长因子（PDGFs）），其中许多已被证明对间充质干细胞的培养有积极影响。例如，Mizuno等人研究了hPL中PDGFs对MSCs增殖的影响，并证明了增殖活性的浓度依赖性增加。此外，几项研究表明，当细胞用hPL培养时，细胞粘附得到增强，这可以通过各种粘附因子如冯·维勒布兰德因子（vWF）、纤维连接蛋白、玻璃连接蛋白和血栓粘连蛋白来解释。近年来，越来越多的研究还表明，hPL增强了3D培养的MSCs的扩散、活性、增殖和分化，以及如果MSCs直接从3D hPL基质中分离出来的优点。总的来说，许多体外研究已经清楚地显示了hPL在成功应用方面的有希望的结果。其中成功的培养包括成纤维细胞、内皮细胞和癌细胞系，使用hPL进行MSCs的分离、扩增和成功分化，或者MSCs基医疗产品的体外培养。
总之，直到开发出有效和通用的化学定义培养基，hPL似乎是MSC制造和细胞程序以及组织工程中应用的最优无异种成分培养基补充剂（与传统使用的FCS相比）。将hPL作为培养基补充剂的应用结合了现代社会伦理、可持续性、回收、健康安全和资源保护的原则。尽管仍需要标准化的无异种成分培养协议和流程以确保hPL处理的质量和安全，但将hPL作为培养基补充剂的使用代表了朝着开发无异种成分人源化培养模型的重要一步。
2.3.无血清和（无异种成分）化学定义培养基
开发无血清、化学定义培养基可以提高间充质干细胞制造的可重复性、放大和成本。它们不包含蛋白质、水解物或其他未知组成的成分。以前从人类或动物血清中分离和纯化的各种激素或生长因子现在可以通过重组技术生产，从而实现完全无异种成分的化学定义培养基的生产，并消除了传播病原体的风险。特别是对于日益重要的质量控制，需要针对体外方法开发通用标准，以符合良好细胞培养实践（GCCP）。这些标准的一部分包括引入化学定义培养基的普遍使用以及用可变的组成的基于动物的、未定义的补充剂的替代。由于MSCs可以根据其分离来源和捐赠者而大不相同，因此对于细胞的最优化学定义培养基的添加剂有几个具体要求。尽管如此，相应的化学定义培养基可以针对要培养的MSCs的特性和需求进行特别修改。因此，即使在分离过程中也可以支持MSC的选择。对于某些细胞类型，特定定义的培养基补充剂（血清和/或无异种成分）已经商业化。然而，开发一种通用的临床规模MSC扩增的化学定义培养基仍然是一个主要挑战。例如，不同的研究表明，在用化学定义培养基培养后，细胞倍增时间、细胞形态和大小以及细胞空泡的变化存在差异。
迄今为止，另一个挑战通常是细胞或细胞培养基质的非无异种成分预处理。许多现有的化学定义培养基需要在含血清的培养基中预孵化或用ECM蛋白预涂覆培养基质以支持细胞粘附。所需的涂覆蛋白往往也是动物来源的，因此无法使用化学定义培养基实现完全无异种成分的培养。
即使化学定义培养基可以针对MSCs的需求、预期的临床目标进行特别定制，并且能够实现可接受的细胞生长，以及克服病原体传播的风险，化学定义培养基仍然无法与FCS或hPL等培养基补充剂的性能相媲美。此外，无异种成分的化学定义培养基还需要针对其他应用进行测试和优化，例如3D培养和放大培养过程（例如附着和剪切应力效率）。迄今为止，商业化的无异种成分化学定义培养基通常不会产生与血清或异种补充培养基相比的最佳细胞生长，并且需要改进在其中培养的细胞的功能特征的评估。因此，无异种成分化学定义培养基尚未普遍适用于初级贴壁细胞和MSC培养，而在化学定义培养基为MSCs优化之前，仍然需要无异种成分补充剂。
3.扩大高细胞数量生产的策略
MSCs属于锚定依赖性细胞类型，这意味着它们需要生长表面以进行体外扩增。传统上，MSCs在培养板或烧瓶中保持低密度。然而，在这些条件下扩增细胞与由于开放操作频率导致的更高的污染风险相关。为了避免人为因素并确保可重复性和更高的通量，开发了封闭的机器人系统以改善二维细胞培养维护。在2D条件下的细胞扩增与一系列通道相关。由于这个过程，MSCs可以改变它们的表型并经历衰老。此外，典型的培养烧瓶需要在孵化器中占据大面积以获得治疗量的细胞质量。因此，已经开发了几种方法和策略来改善体外扩增和扩大MSCs培养（图12.2）。
3.1.在烧瓶中培养
为了减少平面细胞维护中的体积-面积比，可以使用多层烧瓶或细胞堆叠器（或细胞工厂）。在这种情况下，实现了“扩展”方法，即相同的表面积被乘以。然而，与批量间变异性相关的典型2D培养缺点主要是当手动处理时固有于这种方法。在细胞堆叠器中培养使得在显微镜下观察细胞变得困难，因为细胞工厂的高度。
另一种减少体积-面积比的方法是在滚瓶中进行。一些瓶子通过粘性壁被纳入加热和旋转架中。贴壁细胞覆盖了这些瓶子的内表面形成单层。在旋转瓶中，细胞被一层薄薄的培养基覆盖，这确保了稳健的气体交换。然而，研究表明滚瓶的MSC扩增能力比传统培养烧瓶差。适用于培养烧瓶和细胞堆叠器的相同缺点也适用于滚瓶。由于手动操作导致的污染风险、批量间变异性和高劳动力需求限制了这种技术在大规模MSC生产中的应用。这种方法现在不常用，主要被认为是一个历史阶段。
3.2.在生物反应器中扩增
相比之下，生物反应器系统展示了更高的可扩展性能力，满足了MSC制造的治疗用途要求。此外，生物反应器被认为是封闭系统，只打开有限次数的操作，如装载、容器连接和收获。通过这种方式，降低了污染风险。除了最简单的模型外，大多数生物反应器都配备了传感器来监测营养利用、代谢物积累、光学密度和其他所需参数。
已经开发了多种不同的生物反应器架构，并可以根据输入功率类型进行分类。机械驱动反应器，包括搅拌罐、波袋和旋转轮反应器，使得粘附在载体上的MSCs能够在不断混合的介质中培养，并达到每毫升105-106个细胞的细胞密度。这使它们更受治疗性细胞制造的欢迎。水力驱动系统，如固定床和中空纤维反应器，包含固定支架供细胞粘附，而介质被泵送到沿着这些结构流动的细胞播种。
搅拌罐是使用最广泛的反应器类型之一，因为它们的结构相对简单、可扩展性和特性良好。在最原始的情况下，搅拌罐反应器由一个带有搅拌器的储罐组成。工作体积高达250毫升的台式反应器通常是表面曝气，而较大的模型可能配备有两个或更多的搅拌器和额外的曝气装置。加速搅拌器旋转速度可以改善混合和氧合，但同时增加了剪切力。作为锚定依赖性细胞类型，MSCs可以在这些系统中培养（1）在微载体上，（2）作为细胞团和（3）包裹在水凝胶中。如果在微载体上培养，混合颗粒和介质流动之间的相互作用防止了几个微载体的聚集形成，并使细胞能够从充满的微载体迁移到空的微载体上。同时，高混合速度不是最佳选择，因为MSCs对剪切应力敏感，这可能影响免疫调节特性，诱导分化或损伤细胞。迄今为止，根据搅拌罐生物反应器的相对简单性，已经进行了众多出版物和协议，并已报告，使这项技术更受新研究和工业应用的欢迎。垂直轮生物反应器的不同几何形状减少了剪切应力，同时实现了有效混合。垂直轮反应器可以根据计算模型扩展到100升。
在波纹生物反应器中，细胞被装载在一个固定在移动和加热平台上的塑料袋内。平台的振荡运动促进了足够的物质和能量传递，同时限制了泡沫的形成。通过这种方式，可以在培养基配方中减少甚至排除抗泡剂。这种生物反应器适合于剪切力敏感的细胞，因为在培养水库内有一个更均匀的剪切力模式。然而，这种类型的生物反应器中聚集体的形成仍然是一个挑战。
无论架构如何，MSCs在所述生物反应器中的培养需要使用载体以实现MSCs的粘附。通常，小型聚合物珠子或微载体被应用以在治疗规模上获得表型稳定的细胞。微载体可以由多种材料制成，并涂覆各种粘附物质。通常，微载体可以分为两大类：平滑和多孔微载体。在第一种情况下，细胞在表面生长而不渗透到核心中。在多孔颗粒中，细胞被困在颗粒内并在里面生长。因此，微载体在相同体积的培养基内提供了比2D系统更大的面积。最近有报道称，在50升搅拌罐反应器中微载体上成功扩增了43倍的MSCs（产量为1.28×10^10个细胞）。为了防止培养过程中的剪切应力，一些协议建议使用特殊的基于微流体的设备将细胞装载在水凝胶球中。或者，细胞可以作为自组装的细胞团或球状体培养。本章稍后将讨论3D培养在球状体中对MSCs特性的可能影响。
通常，使用球状体更接近模拟自然组织条件。同时，为了促进细胞团的自组装，需要在生长介质中存在包括重组vitronectin、整合素和层粘连蛋白在内的粘附分子，这使得在球状体中大规模GMP生产MSCs相对昂贵。
在微载体或凝胶珠上扩增MSCs的下一个重要挑战是收获过程。传统上，使用蛋白水解酶进行细胞分离，然而，延长的酶处理可能会影响细胞免疫表型。为了避免这一点，有建议使用酶混合物结合减少暴露时间。分离后，细胞可以通过具有适当孔径的过滤系统与微载体分离，该系统保留微载体并允许细胞通过。此外，还可以应用其他方法，如热敏微载体，以实现无需酶的MSCs收获。
MSCs表面配体与它们所附着的微载体之间的相互作用调节了关键的信号传导途径。天然材料，即体内细胞外基质的组成部分，如胶原蛋白和明胶，提供了高生物相容性。胶原蛋白和明胶也促进了细胞附着。此外，基于明胶和胶原蛋白的微载体可以被酶消化，这改善了收获。然而，由于许多这些材料来源于动物，因此不推荐用于临床实践。或者，合成聚合物，通常是基于聚苯乙烯的，代表了一种定义明确且无异种成分的微载体生产材料。它们的生物相容性和细胞附着支持可以通过物理表面处理或涂覆模仿自然配体的合成聚合物来改善，以促进细胞附着和增殖。机械驱动的旋转床生物反应器的结构包括作为细胞载体的塑料板。这种类型的反应器结构包括一个带有多个粘附板的旋转圆柱形储层。这种方法有望实现高达6000平方厘米的培养面积。
水力驱动生物反应器通过连续培养基流动提供细胞维持。例如，中空纤维反应器由多个半透性中空纤维组成，放置在圆柱形储层中。细胞可以在纤维内播种，而培养基不断沿其外表面流动。或者，对于一些模型来说，相反的播种原理是可用的：细胞在培养基中被播种在中空纤维的外表面，而氧合培养基在它们内部流动。中空纤维反应器能够获得每毫升10^9个细胞的细胞密度。此外，几个单元可以并行连接，这使得可以扩大规模原则。在使用中空纤维生物反应器工作时需要克服的挑战之一是，当培养基或解离试剂沿纤维流动时形成的纵向浓度梯度，因此可能导致营养物质或解离试剂的分布不一致。
固定床生物反应器包括一个由多孔珠子、圆盘或水凝胶制成的固定细胞载体，用含氧和营养物质的培养基灌注。这种类型的反应器可以达到每毫升10^8个细胞的高细胞密度。固定床结构的另一个优点是大约500平方米的大培养面积，用于工业细胞制造。在大规模上，由于反应器结构，可以出现轴向和径向浓度梯度。与基于微载体的培养类似，由于解离试剂的复杂分布以及固定床中的高细胞包装密度，细胞收获仍然是一个挑战。
在所有动态系统中，剪切应力被认为是限制大量生产表型稳定、增殖率高的细胞质量的一个限制因素。关于剪切应力对增殖率的影响存在争议的发现；然而，大多数作者都同意剪切应力诱导成骨和软骨分化的事实。剪切力不仅在生物反应器中影响扩增的MSCs，而且在随后的下游过程中也影响它们。通常，下游过程包括细胞分离、浓缩、洗涤、配方和冷冻保存。下游过程开发的原则旨在保护细胞活力和功能。下游策略需要满足GMP要求，可扩展、自动化、封闭并在短时内进行。此外，根据培养技术省略一些过程步骤可能是一个优势。例如，在自组装聚集体中培养细胞不仅模拟体内条件，而且同时不需要从微载体中分离细胞。
4.生理性缺氧对间充质干细胞（MSC）生产的影响
氧气是高等生物生存的关键元素。众所周知，过高或过低的氧浓度都可以作为生物应激因素。因此，在生理相关的低氧条件下培养已被证明对MSC制造领域的一些应用是有益的。理解缺氧的不同效应对于生产临床相关的细胞数量、MSC衍生产品或移植构建物是必要的。
4.1.氧稳态的生化调节
对于维持细胞和组织稳态，所有脊椎动物和较大的无脊椎动物的所有细胞适应低氧可用性至关重要。所谓的缺氧诱导因子（HIFs）已被确定为氧稳态的主要生化调节器。发现HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的异二聚体蛋白，它们直接与DNA在主沟中相互作用。HIF-1α和HIF-1β mRNA在大多数，如果不是全部，人类和小鼠组织中表达，甚至在秀丽隐杆线虫中发现了保守的同源物。虽然HIF-1似乎在所有细胞核中的转录机制中对缺氧诱导信号具有非常基本的作用，但其另外两个异构体在氧稳态中显示出更专业或有限的作用。在非缺氧条件下，恒定翻译的 HIF-1α亚基经历蛋白酶体降解，但在缺氧条件下稳定（参见图12.3）。HIF-1α随后被转移到细胞核中，在那里它与HIF-1β二聚化。HIF-1及其共激活因子结合到DNA中发现的缺氧反应元件（HRE）的共识序列，这些序列具有五个核苷酸的保守序列。Schödel等人基于ChIP的分析揭示了在500多个基因位点上超过400个潜在的HIF-1结合位点，具有高度严格性。由HIF-1控制的主要基因包括细胞生长和凋亡基因，能量和铁代谢基因，以及参与pH控制和血管生成或红细胞生成的基因。HIF-1还能够激活其他转录因子，如SOX9，它在MSCs的软骨生成中具有核心功能。在正常氧条件下，HIF-1α的稳定也可以发生：生长因子和细胞因子在这一过程中发挥主要作用。
图12.3 在正常氧和低氧条件下HIF-1的主要调控机制。（改编自“Organoid Production Methods Overview”，由BioRender.com（2022年）提供。检索自https://app.biorender.com/biorender-templates）
4.2.氧对MSC生理学的影响
在体内，MSCs可以在许多不同的组织类型中找到，如脂肪组织、骨髓或脐带血等。这些组织中的氧浓度低于大气中的氧浓度：例如，脂肪组织的氧浓度在5.3%到7.3%之间变化，骨髓的氧浓度估计在1%到7%之间。因此，生理氧浓度（通常也称为“生理性缺氧”或“生理氧”）通常远低于传统细胞培养中应用的21%环境氧。这意味着在生理相关的氧张力下培养MSC可以更密切地再现这些细胞的分化或增殖的本地信号的影响，因此可能对其培养产生积极影响。此外，在缺氧条件下培养对于MSCs在缺血、受损组织中移植后的细胞存活也可能很重要。缺氧对MSC生物学的影响已在文献中进行了研究和广泛讨论。据报道，缺氧对MSCs有许多积极影响。在缺氧条件下培养时，MSCs已被报道显示出增加的细胞增殖和保持干性，这是MSCs成功扩增的关键特征。此外，缺氧预处理刺激可能通过其分泌功能增加MSCs的再生潜力：在各种研究中，MSCs缺氧预处理后分泌的促血管生成和促生存因子增加。缺氧预处理还导致在植入缺血性心脏组织后细胞存活率提高，可能通过预先对细胞进行引导来避免缺氧诱导的凋亡。根据MSCs的目标应用，也可以利用缺氧对不同3D细胞培养应用中软骨生成分化的积极影响。相反，对于成骨和成脂分化的数据存在冲突：虽然一些研究报告了增强的成骨和软骨生成分化，其他报告则报告了降低的成脂性或受损的成骨分化。Samal等人最近对这些差异的综述提供了一个全面的概述，使用了30多项研究中的培养条件和观察到的对MSC命运的影响。
尽管缺氧对MSCs有上述积极影响，但关于在缺氧条件下培养MSCs是否普遍具有积极效果，存在相互矛盾的证据。这些关于缺氧效应的不同发现可能是由于在不同的实验设置下检验缺氧效应时极端的变异性所致：首先，作者们认为的“缺氧”氧张力在1%到10%之间有所不同，暴露于低氧浓度的时间和持续期在研究之间也有很大差异。暴露于缺氧的时间从几小时到几周不等。其次，所检查的MSCs可能不仅来自人体组织，而且通常也来自各种其他物种（例如，小鼠、大鼠、猪、兔子等）。此外，MSCs可能的组织来源的多样性也造成了更多的变异性。这些研究中的培养方法在传统的2D培养和不同的3D培养系统之间变化。此外，在一些研究中，使用缺氧模拟试剂而不是降低氧浓度本身。最后，也使用了不同的培养基和补充组合。上述影响缺氧对MSCs增殖行为、分化和存活率的方面显示了根据各自的培养方法和目标组织组合调整培养条件的重要性，以便在MSC培养期间获得最佳结果。
5.将MSC生产带入第三维度
MSC培养的另一个重要的生理方面是其微环境的组成。在2D中培养细胞已经在全世界成千上万的实验室中进行了100多年的常规操作。尽管2D培养劳动强度较小，成本较低，但在单层培养中几乎无法再现细胞在其原始组织中会遇到的生理条件。在2D培养中，细胞-细胞相互作用与生理环境中的根本不同。这里，只提供了培养容器的均匀接触表面（图12.4）。通常，细胞-细胞和细胞-基质相互作用对于维持和推进细胞分化、结果表达谱以及迁移至关重要，因此也对细胞对刺激的反应至关重要。细胞的三维（3D）培养为重现更接近体内微环境的许多问题提供了解决方案。3D细胞培养中的不同技术可以被分类为体外移植物培养、作为3D细胞聚集体（球状体）的培养或在/不同基质上培养，即使用去细胞外基质、浓缩介质、基于凝胶的物质或支架。
图12.4 二维与三维细胞培养条件的比较
5.1.MSC在球状体中的培养
由于其制造简单、可扩展性以及对MSC生物学的潜在积极影响，球状体已被广泛研究用于MSCs的扩增和MSC衍生应用。球状体的生产基于许多粘附细胞自然倾向于彼此形成聚集体。这导致了在没有它们可以粘附的表面的情况下发展出球形的细胞聚集体。与其他3D培养方法相比，球状体的一个明显优势是不需要粘附基质来创建球状体。此外，球状体可能非常适合于高通量制造的应用，这取决于生产球状体的方法。如上所述，MSCs在细胞聚集体中的培养还允许在细胞生产中涉及不同类型的生物反应器。
获得细胞聚集体有不同的方法：从历史上看，通过液体覆盖或搅拌罐方法获得球状体，这两种方法都能产生相对异质的细胞聚集体群体，但能够产生大量的球状体。通过搅拌罐技术制造球状体，通过搅拌罐来最小化细胞-表面接触，同时力求最大化在高密度细胞悬浮液中促进的细胞-细胞接触。尽管高搅拌速率对球状体的形成至关重要，但它可能会对细胞造成损害。液体覆盖方法通过一层琼脂糖凝胶阻止细胞粘附到表面。涂有细胞排斥剂的细胞培养瓶允许生产更多的球状体，但球状体的大小不一。其他目前使用的方法是通过悬挂滴技术或使用低附着微孔板产生细胞聚集体。这两种方法都能产生均匀大小的细胞聚集体，但大量生产更加困难。一种更现代的方法是使用所谓的微结构板生成球状体：这些能够生产大量的球状体，但已经显示出整个板中氧浓度分布不均。最后，还有其他需要更专业设备的方法：例如，旋转壁容器或磁悬浮以及微流体系统也可以用于创建球状体（图12.5）。尽管球状体制造方法似乎在一定程度上影响确切的实验结果，但已经表明在球状体中培养MSCs可以有许多积极的影响。首先，MSCs可以形成细胞-细胞相互作用并表现出细胞极性，这是球状体与传统2D细胞培养相比的一个关键优势。此外，球状体培养导致维持MSCs的干性以及分化潜力，并且还可以积极影响其旁分泌能力：抗炎、血管生成和免疫调节潜力在MSCs在微球体中培养时得到了积极的影响。此外，在球状体中培养了短时间的MSCs，随后作为单层扩增，显示出增加的再生潜力、更大的扩增能力、减少的衰老，以及改善的体外迁移和体内伤口愈合。
正如大多数，如果不是所有，细胞培养平台的情况一样，也已经表明细胞培养基的组成对形成的球状体有不可忽视的影响。尽管在无血清条件下扩增MSCs是可能的，但Ylostalo等人表明，与补充血液衍生或重组人血清白蛋白的化学定义、无异种成分的培养基相比，在几种其他商业干细胞培养基中培养的球状体，例如α-MEM，其球状体更紧密，具有更高表达的抗炎和抗癌分子。
5.2.基质基础培养
自从Carrel和Burrows在1911年首次进行3D细胞培养以来，基于基质的3D细胞培养解决方案的范围已经大幅增长。在基于基质的方法中培养的关键优势在于可以形成细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)接触，更密切地模仿体内微环境。3D基质还由于扩散限制，导致效应蛋白（即分泌的生长因子）的局部浓度更高。
可以在培养基质上进行培养的基本区分，这些基质作为细胞粘附的表面，以及由高含水量的三维聚合物网络组成的水凝胶。在基质上培养时，细胞可以粘附并沿基质结构迁移。为此目的可以使用丝素、胶原、层粘连蛋白或海藻酸等可生物降解材料。许多基质的一个主要缺点是粘附的细胞通常具有平坦的形态，这在2D培养中更常见。另一方面，水凝胶在3D细胞培养中非常常用。现在使用由天然、半合成和合成材料制成的各种水凝胶，它们在刚度、网孔大小和对细胞的影响方面具有不同的属性。天然来源的聚合物具有丰富、可生物降解，并且通常可以在温和条件下凝胶化的优势。它们通常也具有低毒性。用于生产水凝胶的最常见天然材料是明胶、糖胺聚糖、纤维蛋白、海藻酸和胶原。合成材料也可以作为基质使用，但它们通常缺乏生物学线索。由于可能的批次间变化以及缺乏所需的机械性能，通常还会对天然来源的起始材料进行化学改性或与合成组分结合，以获得改进的、可控的属性。控制基质的机械刚度是一个主要优势，因为MSCs - 鉴于它们的可塑性，因此能够以不同的方式适应不同的细胞环境 - 从它们的微环境中获得机械线索，并承诺由基质弹性指定的谱系，正如Engler等人的发现所强调的。作者能够表明，不同刚度的I型胶原涂层聚丙烯酰胺凝胶即使在没有诱导分化的可溶性因子的情况下，也能刺激软凝胶上的神经源性分化。中等基质弹性被证明是肌源性的，而坚硬的基质导致MSCs的成骨分化。其他培养基质对MSC分化的影响，包括由拓扑诱导的强迫细胞几何形状和接种密度与基质刚度的相互作用也进行了研究。
5.3.3D细胞培养的限制
与其他任何体外培养技术一样，3D培养MSCs也有限制，在选择合适的培养平台时必须考虑这些限制。首先，将球状体或基质中培养的MSCs用于再生医学的限制仅限于定向注射，不能直接应用于需要静脉或动脉内注射的系统性疾病，而无需解离。然而，要从3D培养中获得细胞悬浮液，必须首先蛋白水解去除细胞-细胞和细胞-基质连接：这可能与从单层培养中分离细胞不同，例如，由于酶向3D结构的扩散限制。如前所述，这一酶步骤可能会降低细胞活力和总细胞数量，还可能导致表面受体的水解，从而改变细胞生理学。其次，将存在从3D结构的中心到其外层的机械和化学梯度（包括废物产品和营养梯度）。这些浓度梯度可能会显示时空变化，可能会改变细胞行为，并将使细胞暴露于一定程度的异质性，并可能显示时空变化。第三，3D培养还会导致结构内形成氧梯度，这可能有益或不想要的效果，正如上一章所讨论的。在组织工程中静态培养3D结构通常不使用超出扩散的主动形式的补充氧合，体外人工组织的血管化仍然是一个主要挑战。这限制了例如活体组织结构的最大厚度。因此，在开发3D细胞培养系统时，必须在细胞对其环境的具体需求和选定的培养条件之间找到平衡。
6.结论和未来展望
在本章中，我们讨论了MSCs体外培养的关键参数。选择合适的培养基补充物、扩大培养策略、在可调节的3D系统中培养以及在2D和3D细胞培养过程中实施缺氧，可以极大地提高最终用于再生医学的基于MSCs的产品的质量。在为MSCs的生产和分化成功建立并批准高效的化学定义无血清培养基之前，人胎盘液（hPL）可以作为无异种成分的2D和3D细胞培养的合适补充物。将来，商业上可用的化学定义培养基将是最佳选择，但迄今为止，在这些培养基中培养还需要额外用蛋白质（如胶原或纤维连接蛋白）涂层细胞培养表面以支持细胞粘附。
生物反应器在MSCs的未来临床应用中具有很高的扩展潜力，因为它们提供了可复制的培养条件，并提供了可控的环境。此外，没有生物反应器系统的实施，过程规模扩大是不可能的。在搅拌罐和波浪混合生物反应器中培养锚定依赖性细胞的挑战仍有待克服。在缺氧条件下扩增MSCs可能对细胞有益，但需要确定对不同来源的MSCs有益的精确氧张力。
越来越多的研究支持这样的理论：在3D系统中扩增细胞可以增加它们的治疗潜力。选择培养条件时，还应考虑次级效应，如由于组织结构中产生的ECM积累或培养过程中细胞数量的增加，导致氧气扩散的额外限制。为了利用3D培养选项的积极效应，主动监测设计的3D结构内的氧分布至关重要。此外，当细胞用于细胞治疗时，从3D培养系统收获细胞仍然是一个挑战。
最后但同样重要的是，必须考虑用于治疗用途的MSCs的质量控制。在大多数情况下，在最终产品阶段和整个生产过程中评估细胞形态、生长速率、核型和无菌性。除了上述参数外，有效的效力测定必须包含在MSCs的质量控制中。考虑到所有上述参数，需要制定MSCs制造的标准协议和指南，以促进真正有效的先进疗法的进一步发展。
