2024年，ETH Zurich的Xiao-Hua Qin等人在《Nature Communications》杂志发表了题为“Synthetic biodegradable microporous hydrogels for in vitro 3D culture of functional human bone cell networks”的论文。
本文主要介绍了一种合成的可生物降解微孔水凝胶，用于体外三维培养功能性人类骨细胞网络。研究团队通过聚合诱导相分离（PIPS）技术，展示了在活细胞存在的情况下，动态形成微孔（5-20微米）的过程。这些微孔结构可以通过调整葡聚糖的浓度和分子量来精细调节。研究结果表明，这种微孔水凝胶能够促进人类间充质干细胞和成骨细胞在24小时内迅速扩散并形成三维网络。此外，研究还探讨了基质可降解性如何控制细胞-基质重塑、成骨分化以及细胞外基质蛋白（如胶原蛋白）的沉积。最终，研究团队还展示了在芯片上通过灌注实现三维细胞网络的成骨分化的概念验证。这项工作为体外研究早期骨发育提供了一种有效的合成微孔水凝胶。
01：摘要
在体外生成三维骨细胞网络，模拟早期骨形成的动态过程仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种合成的可生物降解的微孔水凝胶，用于从人原代细胞有效形成3D网络，分析细胞分泌的细胞外基质(ECM)和微流体整合。利用聚合诱导相分离，我们证明了在活细胞存在的情况下，在基质金属蛋白酶可降解的聚乙二醇水凝胶中动态地原位形成微孔(5~20 μm)。孔隙形成是由含有透明质酸和葡聚糖的粘性前体溶液的巯基-迈克尔加成交联引发的。通过调节右旋糖酐的浓度和分子量，可以微调微孔结构。人间充质基质细胞和成骨细胞经微孔水凝胶包封后，在24小时内迅速扩散并形成三维网络。我们证明，基质可降解性控制着细胞-基质重塑、成骨分化和ECM蛋白(如胶原)的沉积。最后，我们报道了芯片灌注下的微流控集成和3D细胞网络成骨分化的概念验证。总之，这项工作引入了一种合成微孔水凝胶来有效地分化3D人骨细胞网络，促进了未来早期骨发育的体外研究。
02：图文赏析
微孔聚乙二醇水凝胶的设计
在本研究中，设计了一种合成的成孔水凝胶，用于生成3D骨细胞网络，以模拟早期成骨过程中成骨细胞的嵌入过程。PEG水凝胶是在葡聚糖和透明质酸（HA）的存在下，通过4-臂PEG乙烯砜（4-PEGVS）和二硫醇交联剂之间的硫醇-迈克尔交联31形成的。聚合诱导相分离（PIPS）是一个动态过程，其中最初可混溶的混合物（单相）在反应性组分聚合过程中发生相分解，从而形成多相混合物32。将组分（4-PEG-VS、HA、葡聚糖和交联剂）重新混合并将温度升至37℃，混合物经历迈克尔加成交联诱导的PIPS（图2a），并通过一个加工步骤33形成具有相互连接孔隙率的PEG水凝胶。HA是必要的，以在适当的范围内（0.3-0.6 Pa s）增加复合粘度，从而防止PIPS过程中相坍塌。加入纤维连接蛋白衍生的精氨酰天冬氨酸肽（N-C:CGRGDSP）以促进细胞附着，而基质金属蛋白酶（MMP）敏感的二半胱氨酸肽11,34（N-C:KCGPQG IWGQCK或GCRDGPQG IWGQDRCG，表示切割位点）和PEG二硫醇33（PEG-2-SH，分子量=2.0 kDa或3.4 kDa）分别用作可降解和不可降解的交联剂。使用荧光标记的4-PEG-VS，通过时间推移共聚焦显微镜证明了动态原位孔形成。在交联过程中，观察到双峰成核的空间模式（图2b，补充电影1）。补充图1和补充影片2显示，PIPS和互连孔隙率仅在使用葡聚糖的相分离水凝胶中观察到。
聚合物组成对水凝胶力学的影响
流变分析表明，将4-PEG-VS的浓度从2.0%增加到2.5%，可降解和不可降解基团的水凝胶都会明显变硬，储能模量（G）范围为30 17.2 Pa至421 169.5 Pa（图2c）。根据水凝胶的组成，凝胶化（G和损耗模量（G）的交叉）在37℃下原位交联后立即开始，并在60分钟后趋于平稳。MMP可降解水凝胶的交联速度比不可降解水凝胶快（补充图2a）。Lutolf等人35证明，交联剂半胱氨酸附近带正电荷的氨基酸残基的存在，如MMP敏感交联剂中的赖氨酸残基，会调节巯基的pKa，从而加速迈克尔加成-PEG水凝胶中的交联动力学。通过将葡聚糖浓度从0.0%增加到1.0%，不可降解和可降解水凝胶的G都增加了。这种效应可归因于葡聚糖对PEG前体的强相分离性能，这可能导致PEG相和更硬水凝胶的局部致密化。然而，改变葡聚糖分子量（MW，40或500 kDa）并没有显著影响水凝胶力学性能（补充图2b）。通过改变HA的浓度，从而改变水凝胶前体的粘度，可以调节水凝胶的刚度（补充图2c）。有人建议，在PIPS33中交联稳定结构之前，高粘度可以防止相坍塌成微球。我们的研究结果表明，当HA的浓度从0.25%增加到0.50%时，HA的加入增强了交联。然而，较高浓度的HA（0.83%）降低了G，表明交联对高粘度制剂的效率较低。有趣的是，流变学测试证明，可降解和不可降解的PEG水凝胶基质中都存在粘弹性行为，这可能是由于HA的存在（补充图2d）。我们最近证明，合成PVA水凝胶中粘性明胶组分的存在提供了应力松弛特性，并使细胞能够快速扩散36。我们的流变学数据显示，含有HA的可降解和不可降解PEG水凝胶在5%的恒定应变下表现出应力松弛（图2e）。这种特性可能有助于细胞骨架重排和3D细胞网络的形成。值得注意的是，块体水凝胶的流变分析可能无法反映细胞所经历的局部水凝胶力学。由于G值较低，基于原子力显微镜的纳米压痕技术未能成功。未来，使用纳米珠的微观流变学可能有助于剖析微孔水凝胶中的机械异质性如何影响细胞行为37。
孔隙结构表征
我们研究了葡聚糖包合物对聚乙二醇水凝胶孔隙结构的影响。如图3a c和补充图3所示，当葡聚糖浓度从0.5%增加到1%和2%时，孔隙半径(中位孔隙半径分别为7.0、10.0和10.0 μm)和孔隙度(中位孔隙半径分别为37.6 4.1、50.4 1.9和55.8 5.9%)增加，孔隙连通性提高。不含右旋糖酐的水凝胶的孔径在亚μ量级，太小而无法定量。此外，右旋糖酐从40 kDa增加到500 kDa导致孔隙半径增大(图3d, e，补充图4)。500 kDa右旋糖酐组的孔隙率(19.7.3.0%)小于40 kDa组(24.7.6.4%)(图3f)。此外，我们评估了物理约束对微流体通道内孔隙形成的影响(补充图5)。与无约束水凝胶相似，高分子量葡聚糖(500 kDa)组的孔半径(中位数:4.2 μm)大于低分子量葡聚糖(40 kDa)组(中位数:2.6 μm)。此外，随着葡聚糖分子量的增加，芯片上的孔连通性增加。这些结果表明，聚乙二醇水凝胶的孔隙结构可以通过葡聚糖浓度和分子量进行微调。这些合成水凝胶的可注射性，以及它们在浇铸在芯片上时保持空隙形成特性的能力，为微流体细胞培养应用带来了希望。
三维骨细胞网络的快速形成和长期稳定性
在这项研究中，我们研究了我们的微孔PEG水凝胶是否能够在体外产生3D骨细胞网络。人间充质基质细胞（hMSC）嵌入MMP可降解和不可降解的PEG水凝胶中，并在成骨条件下分化。已知MMPs对hMSC分化以及成骨过程中成骨细胞的存活至关重要39。因此，我们认为，只有当细胞能够通过MMPs的蛋白水解重塑周围的基质时，它们才能形成具有长期稳定性的相互连接的3D细胞网络（图4a）。在可降解和不可降解水凝胶中，hMSC在第2天的存活率均高于80%（图4b）。值得注意的是，在嵌入水凝胶后1.5小时和24小时，分别观察到这些微孔水凝胶内的超快细胞扩散和3D细胞网络形成（补充图6）。当嵌入MMP可降解水凝胶中时，hMSC会不断重塑其环境，并保持3D细胞网络至少35天。平均细胞面积的量化进一步证明了可降解水凝胶对hMSC的允许性（图4c）。可降解水凝胶中的平均细胞面积明显大于不可降解水凝胶。在第8天，可降解水凝胶中形成了广泛的3D细胞网络。相比之下，不可降解水凝胶中细胞网络形成的程度明显较小（图4d，补充图7）。当在更宽松的环境中生长时，hMSC形成了多个树突过程，将它们与相邻细胞连接起来。基于hMSC培养的成功，我们进一步测试了微孔PEG水凝胶对人成骨细胞（hOB）三维成骨培养的适用性。可降解组和不可降解组包埋后的细胞存活率均在90%以上，培养2天后仍保持较高水平（补充图8）。与hMSC相似，可降解和不可降解水凝胶之间的细胞形态存在差异（图4e）。使用ImageJ NeuriteQuant40（图4f）对细胞牙本质进行定量分析表明，可降解PEG凝胶中的hOB具有更长的树突过程（图4g），尽管其平均细胞面积相似（图4h）。此外，我们观察到，添加细胞粘附性RGD肽对hOB扩散和网络形成至关重要（补充图9）。值得注意的是，我们证明了通过增加葡聚糖浓度和孔径来操纵多孔结构会影响hOB形态（补充图10a）。与孔径较小的水凝胶（0.2%葡聚糖）相比，孔径较大的细胞薄PEG水凝胶（1.0%葡聚糖）在成骨培养的第二天显示出明显更大的细胞面积（补充图10b）和更长的树突（补充图10c）。总之，我们的研究结果强调了基质可降解性和多孔结构在hMSC和hOB形成长期稳定的3D细胞网络中的重要性。
hMSC在静态PEG水凝胶培养中的成骨分化
接下来，我们研究了hMSC在微孔PEG水凝胶中的成骨分化与基质降解性的关系。活死染色分析显示，在14天和21天时，两种水凝胶的细胞存活率都很高（>95%）（图5a，补充图11）。DNA分析表明，在最初的7天里，两组的细胞数量都有显著的初始增加，随后细胞数量减少（图5b）。在14天和21天时，可降解水凝胶中的碱性磷酸酶（ALP）活性明显更高（图5c）。此外，实时定量PCR（RT-qPCR）数据显示，与不可降解水凝胶相比，从第7天到第21天，可降解水凝胶中ALPL基因表达明显增加（图5d）。14天时，可降解水凝胶中的RUNX2基因表达较高（图5e）。此外，参与破骨细胞树突形成41的MMP14和PDPN在可降解水凝胶中的表达程度更高（图5f，g）。免疫荧光染色显示，随着时间的推移，两种水凝胶中I型胶原的表达（补充图12a，c；补充图13中的阴性对照）。然而，与不可降解的水凝胶相比，I型胶原在可降解水凝胶中的分布更为广泛。值得注意的是，在第21天，可降解的PEG水凝胶中podoplanin的表达明显高于不可降解的水凝胶（补充图12b，d）。随着成骨分化的进行，载有细胞的水凝胶变得越来越不透明。因此，制备了第8天（补充图14）和第30天（图6）相同培养物的组织切片，以进一步比较细胞形态、胶原蛋白分泌、基质矿化和骨钙素表达。与非切片样品类似，结果表明，与不可降解水凝胶相比，可降解水凝胶在第8天促进了明显的细胞网络形成（补充电影3），该网络至少保持稳定30天。Picrosirius红偏振成像显示，在第8天存在细胞分泌的胶原纤维，特别是在MMP可降解水凝胶中，这是由于其对细胞基质重塑的允许性。重要的是，考虑到所有可检测的胶原纤维都是由包埋细胞产生的，微孔PEG水凝胶的合成性质允许评估胶原分泌。这在传统的蛋白质水凝胶中是无法实现的，如I29型胶原蛋白和明胶衍生物42。胶原蛋白含量和成熟度根据纤维色调法进行定量，如前文所述43。图6b显示，不可降解水凝胶中存在更多的绿色和黄色，对应于低纤维厚度和未成熟胶原蛋白。相比之下，MMP可降解水凝胶中的细胞产生了更成熟的胶原纤维，如红色比例较大所示（图6c）。此外，从第8天到第30天，红色含量显著增加。茜素红染色进一步表明，与30天后的不可降解水凝胶相比，基质矿化增强，特别是在可降解水凝胶内嵌入细胞附近（图6d）。与第8天相比，第30天矿物质沉积的增加意味着hMSC的3D成骨分化为更成熟的骨细胞表型。骨钙素是成熟成骨细胞的标志物3，在培养30天后主要在MMP可降解水凝胶中表达。
3：原文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-024-49280-3
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