夏占峰团队 | 稀释培养基结合添加诺氟沙星挖掘塔克拉玛干沙漠微生物资源

【背景】塔克拉玛干沙漠属于典型高温干旱极端环境，该地区的微生物经过长期的环境适应，物种分布极具地域特色。【目的】获得塔克拉玛干沙漠极端环境可培养微生物资源，并探索不同稀释浓度培养基结合添加诺氟沙星对塔克拉玛干沙漠微生物分离培养的影响。【方法】采用不同稀释浓度的高氏一号培养基、LB培养基和R2A培养基，添加诺氟沙星终浓度为0.015 μg/mL，分离培养塔克拉玛干沙漠微生物并对分离株进行药敏试验。【结果】共分离鉴定246株菌，分属于4个门6个纲21个目29个科58个属221个种。优势菌门为Firmicutes、Actinobacteria；优势菌纲为Bacilli、Actinomycetia；优势菌目为Bacillales、Streptomycetales；优势菌科为Bacillaceae、Streptomycetaceae；优势菌属为Streptomyces、Bacillus和Nocardiopsis。其中有80株菌最大相似度低于98.65%为疑似潜在新物种，2株菌最大相似度低于95.00%为疑似潜在新属。对分离获得的221个菌株进行了药敏试验，43株菌对诺氟沙星表现出抗药性，其中Streptomyces占主导；25株菌对诺氟沙星表现出中等耐药性。【结论】不同稀释浓度培养基结合添加诺氟沙星有利于塔克拉玛干沙漠极端环境微生物的分离培养，经分离培养获得了大量的极端环境微生物菌种资源，发现了大量微生物新物种及耐药性菌株，为后续挖掘耐药性菌株和探索极端环境微生物资源提供了研究基础。

极端环境成为当前微生物生态学研究的一个重要领域，深受国内外微生物学家的重视^[1]。塔克拉玛干沙漠位于新疆南部塔里木盆地中心，是中国第一大沙漠、世界第十大沙漠，也是世界第二大流动沙漠。荒漠生态系统由于特殊的环境致使研究方法受限，使得其微生物研究起步较迟。直到1948年，Fletcher等^[2]首次对美国地区沙漠土壤结皮开展研究。沙漠生态系统作为极端环境之一，气候干热、水分蒸发强、营养水平低、盐碱化程度高、植被覆盖率较低、生物量和生物多样性极低，因此沙漠不适宜生命体存活^[3]，但在如此恶劣的生存条件下，却拥有大量的具有特殊抗逆性基因的微生物资源^[4]。微生物作为沙漠生态系统的重要组成部分，参与了重要的生态过程，能够促进物质分解、养分转化、能量流动和生物化学循环，对于稳定荒漠生态系统、完善生态功能有重要意义^[5-6]。

培养方法是以获得可培养微生物为目的研究微生物多样性、开发新的菌种资源的方法。通过试验发现依靠传统纯培养方法分离得到的微生物仅占自然环境中所有微生物的1.0%，可培养的原核生物有0.1%^[7]，早期单纯的分离培养方法并未客观地反映土壤微生物的群落构成，为了更真实地反映土壤中的微生物群落结构、获得更多的菌种资源，越来越多的培养手段应用于微生物多样性研究中，如稀释培养、富集培养、混合培养和原位培养等手段。

控制培养基的营养水平是提高微生物分离培养水平的有效手段，适当稀释的培养基有利于寡营养环境微生物的分离培养。目前，通过使用低营养浓度的培养策略，针对未培养微生物的培养已经取得一些成效^[8]，何媛秋等探究不同营养浓度培养基对南海沉积物细菌分离培养的影响，发现营养浓度较低的培养基更容易获得稀有和新的微生物类群^[9]。

抗生素是一种选择性地抑制其他微生物的生长繁殖甚至杀死其他微生物的物质^[6]，添加抗生素可以抑制生长速度快的、易形成菌苔的微生物，使生长速度慢的稀有微生物得以获得生长空间，形成单菌落，便于进行后期分离纯化工作。Takahashi等采用新生霉素作为抑制剂取得了良好的分离效果，分离出了2个新属、5个新种和1个新亚种^[10]。喹诺酮类药物的作用机制是抑制病原菌的DNA合成及复制^[11]，诺氟沙星作为第3代喹诺酮类药物，进一步扩大了抗菌谱和抗菌活性，包括抗细胞内繁殖的病原体^[12]。前期开展了添加抗生素对新疆特殊生境微生物分离培养的影响研究^[13]，结果表明，添加抗生素对微生物的分离培养具有良好的效果，其中采用0.015 μg/mL诺氟沙星的分离效果最好。

本研究以塔克拉玛干沙漠样品为研究对象，采用不同稀释浓度的LB、R2A和高氏一号分离培养基为基础，添加0.015 μg/mL的诺氟沙星，对塔克拉玛干沙漠微生物进行分离培养，挖掘塔克拉玛干沙漠微生物资源，确定塔克拉玛干沙漠可培养微生物种属分类，并探讨稀释营养培养基和添加诺氟沙星对塔克拉玛干沙漠微生物分离培养的影响。

2.1  培养基稀释浓度对微生物分离培养的影响

采用终浓度为1、1/2、1/5、1/10、1/15和1/20的LB、R2A和高氏一号分离培养基，整体而言，培养基稀释浓度为1/2时菌落生长状况最好，形态清晰，种类最为丰富；其次是稀释浓度为1、1/5、1/10和1/15的LB培养基；在1/20稀释浓度的培养基上的生长情况长势较弱，菌落多样性较少。洛浦县、于田县土样在各稀释浓度梯度LB培养基上的出菌情况见图1。

图1  洛浦县、于田县土样在各稀释浓度梯度LB培养基上的菌落情况

Figure 1  Bacteria emergence of soil samples from Luopu County and Yutian County on LB medium with different dilution concentration gradients.

2.2  添加诺氟沙星对微生物分离培养的影响

选取于田县、洛浦县、阿拉尔市、且末县和沙雅县5处沙漠样品，探索诺氟沙星对微生物分离培养的影响。添加诺氟沙星于分离培养基中，对比不同稀释浓度培养基形成菌落的形态和数量，判断添加诺氟沙星对微生物分离培养的影响。未添加诺氟沙星的培养基表面易形成连片菌苔，不易形成单菌落，且会抑制生长速度慢的微生物的生长繁殖，5份土样未添加诺氟沙星与添加诺氟沙星的形成菌落情况见图2。添加0.015 μg/mL浓度的诺氟沙星培养基形成菌落的平均数量见图3。

图2  五份土样空白对照与添加诺氟沙星的形成菌落情况

Figure 2  Colony formation in five soil samples compared with the addition of norfloxacin.

图3  添加0.015 μg/mL诺氟沙星对土样菌落平均数量的影响   A：于田县土样. B：洛浦县土样. C：阿拉尔市土样. D：且末县土样. E：沙雅县土样

Figure 3  Effect of 0.015 μg/mL norfloxacin supplementation on the average number of soil-like colonies. A: Yutian county soil sample. B: Luopu county soil sample. C: Alar city soil sample. D: Qiemo county soil sample. E: Shaya county soil sample.

2.3  塔克拉玛干沙漠微生物的种类

塔克拉玛干沙漠不同样点采集的样品经过分离培养获得大量微生物菌株，经16S rRNA基因测序和序列比对分析，菌种信息见表2。塔克拉玛干沙漠土壤共分离获得246株菌，经种类鉴定分属于4个门6个纲21个目29个科58个属221个种，优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)；优势菌纲为是Bacilli、Actinomycetia；优势菌目为Bacillales、Streptomycetales；优势菌科为Bacillaceae、Streptomycetaceae；优势菌属为Streptomyces、Bacillus和Nocardiopsis。其中80株菌最大相似度低于98.65%为疑似潜在新物种，其中有2株菌最大相似度低于95.00%为疑似潜在新属。

在分离鉴定的246株细菌中，选取非重复的221株细菌的16S rRNA基因序列保存在GenBank数据库中，登录号为OR434619–OR434839。

表2  分离培养获得的塔克拉玛干沙漠微生物

Table 2  Classification of microorganisms in Taklimakan Desert obtained by isolation and culture

2.4  不同菌属纯培养菌株的形态

经鉴定塔克拉玛干沙漠土样共分离获得58个属，部分代表菌属纯培养菌落形态见图4。

图4  部分菌属代表属种的纯化菌株形态

Figure 4  Morphology of purified strains from partial bacterium genera and species.A: Limimaricola. B: Altericroceibacterium. C: Luteimonas. D: Micromonospora. E: Cystobacter. F: Brevundimonas. G: Georgenia. H: Thalassobaculum. I: Nocardiopsis. J: Myceligenerans. K: Shigella. L: Lysobacter. M: Saccharothrix. N: Croceicoccus. O: Sutcliffiella. P: Terribacillus. Q: Cytobacillus. R: Modestobacter. 

2.5  塔克拉玛干沙漠不同区域样品微生物的群落结构差异

塔克拉玛干沙漠共分离鉴定获得58个菌属，菌属分布见图5。添加诺氟沙星于不同稀释浓度的3种分离培养基进行分离培养，塔克拉玛干沙漠不同经纬度采样地点获得的可培养微生物的群落结构差异见图6A。

于田县土样分离得到菌株分布在21个菌属，优势菌属是Bacillus，占比为20.0%，7个独特菌属为Altericroceibacterium、Blastococcus、Cystobacter、Modestobacter、Nocardioides、Rhizobium和Verrucosispora，其中获得39株疑似新菌种。

洛浦县土样分离得到菌株分布在20个菌属，优势菌属为Nocardiopsis和Streptomyces，占比为21.3%，有8个独特菌属为Alkalihalobacillus、Brevundimonas、Coralloluteibacterium、Luteimonas、Microvirga、Pseudomonas、Rossellomorea和Ureibacillus，其中获得23株疑似新菌种。

阿拉尔市土样分离得到菌株分布在16个菌属，优势菌属为Bacillus、Cytobacillus、Streptomyces，占比为12.9%，有3个独特菌属为Microbacterium、Salinarimonas和Salirhabdus，其中获得5株疑似新菌种和1株相似度为94.22%的疑似新菌属。

且末县土样分离得到菌株分布在23个菌属，优势菌属是Streptomyces，占比为34.6%，其中有6个独特菌属为Falsirhodobacter、Leifsonia、Litchfieldia、Lysobacter、Myceligenerans、Sphingomonas，其中获得16株疑似新种和1株相似度为94.89%的疑似新属。

沙雅县土样分离得到总计21个属的微生物菌株，其中优势菌属Streptomyces，占比为16.6%，有13个独特菌属为Altericroceibacterium、Aquibacillus、Chelativorans、Croceicoccus、Delftia、Georgenia、Limimaricola、Pelagibacterium、Phenylobacterium、Plastorhodobacter、Sediminibacillus、Sutcliffiella和Thalassobaculum，其中获得了16株疑似新菌种。

在5份土样中均分离获得3个属，分别为Streptomyces、Bacillus和Metabacillus，Streptomyces属于放线菌门，Bacillus和Metabacillus属于厚壁菌门，占总属的5.2%。在属的层面上，揭示出了5份土样的主要差异，不同采样点体现出对某些特殊类群细菌的选择性，每份土样均能分离获得其他土样培养不出的特殊菌(图6B)。

图5  塔克拉玛干沙漠分离到的菌属分布

Figure 5  The distribution genus of the strain was isolated from the Taklimakan Desert.

图6  不同土样分离可培养微生物属水平群落结构(A)及属水平数目韦恩图(B)

Figure 6  Community structure of culturable microorganisms at genus level (A) and Venn diagram of number at genus level (B) obtained from different soil samples.

2.6  不同稀释浓度培养基获得的菌属分布

在不同稀释浓度梯度培养基条件下对塔克拉玛干沙漠微生物分离培养，获得的微生物在属水平上的多样性如图7所示。

LB各浓度梯度共获得167个种分属于50个属，其中Streptomyces、Nocardiopsis在LB培养基多个稀释浓度梯度均有获得；Alkalihalobacillus、Aquibacillus、Chelativorans、Coralloluteibacterium、Luteimonas、Rossellomorea和Ureibacillus这7个菌属只在LB培养基中发现；Brevundimonas、Lysobacter、Microvirga、Myceligenerans、Plastorhodobacter和Thalassobaculum这6个菌属只在1/2 LB培养基中发现；Cystobacter、Roseomonas和Terribacillus这3个菌属只在  1/5 LB培养基中发现；Altericroceibacterium、Modestobacter、Nocardioides、Pseudomonas、Rhizobium、Salinarimonas、Salirhabdus和Verrucosispora这8个菌属只在1/10 LB培养基中发现；Croceicoccus、Microbacterium、Saccharothrix、Sphingomonas和Sutcliffiella这5个菌属只在1/15 LB培养基中发现。

R2A各浓度梯度共获得49个种分属于20个属，其中Bacillus、Streptomyces在1/2 R2A、1/5 R2A和1/10 R2A中均有发现，R2A和1/20 R2A仅获得1个属均为Paracoccus；有2个菌属Leifsonia和Massilia只在1/2 R2A培养基中发现；Altericroceibacterium、Limimaricola、Litchfieldia、Phenylobacterium、Pseudarthrobacter和Terribacillus这6个菌属只在1/5 R2A培养基中发现；Blastococcus、Falsirhodobacter、Micromonospora和Saccharothrix这4个菌属只在1/10 R2A培养基中发现；Falsirhodobacter只在1/15 R2A培养基中发现。

图7  不同稀释浓度的LB (A)和R2A (B)培养基获得的菌属分布

Figure 7  Distribution of bacterial genera obtained from LB (A) and R2A (B) medium with different dilution concentrations.

2.7  药敏试验结果

采用琼脂扩散法对塔克拉玛干沙漠土样分离鉴定获得的221株菌进行药敏试验，共有  43株菌为诺氟沙星抗药株，其中Streptomyces占主导共15株；获得15株诺氟沙星中等耐药株，其中Streptomyces占4株；其余163株为对诺氟沙星敏感株。耐药性菌株占总分离菌株数的26.24% (表3)。

表3  耐药性菌株信息

Table 3  Information on resistant strains

R：耐药；I：中介

R: resistance; I: Intermediary.

采用LB、R2A和高氏一号3种培养基分离培养，观察菌落的形态、颜色、大小等特征，LB平板中的菌落数量多且种类更丰富，而高氏一号平板的菌落形态较单一，挑取菌株时以LB、R2A平板中的单菌落为主，高氏一号平板的单菌落作为补充。LB培养基是一种营养物质丰富、能够满足大多数细菌生长的培养基；R2A培养基虽然由碳源、氮源、矿物质、维生素、普通和特殊的增添剂等多种成分组成，其中丙酮酸钠可增强细菌的复苏，但R2A培养基为寡营养培养基，因此分离培养微生物的效果次之；高氏一号主要是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，分离到的多为链霉菌，因此培养基分离效果最好的是LB培养基，其次是R2A培养基，最后是高氏一号培养基。

沙漠微生物在1/2稀释浓度的分离培养基上的分离效果最好，形成微生物菌落的种类和数量最为丰富多样，由于原浓度培养基营养成分相对较为丰富，生长的多为生长速度快的常见微生物，甚至会抑制生长缓慢的稀有微生物，因此原浓度相较于1/2浓度分离培养基的分离效果较差。在1/20稀释浓度的分离培养基上，5种土样的微生物菌落生长较羸弱，微生物种类不多，由于稀释浓度为1/20的分离培养基营养水平较低，且添加抗生素会抑制部分微生物的生长，因此当培养基稀释浓度低于1/20时不适于添加诺氟沙星进行分离培养。大部分经稀释处理后的分离培养基都获得了独特菌属。本研究结果表明，使用合适稀释的培养基更有利于分离获得更多塔克拉玛干沙漠寡营养微生物，仅使用传统培养基难以获取的某些特殊微生物。结合采用富营养的传统培养基和寡营养的稀释培养基对塔克拉玛干沙漠微生物进行研究可以更好地反映出微生物资源多样性，为进一步对塔克拉玛干沙漠微生物资源的研究和利用奠定基础。

本研究过程中有些菌株在低浓度培养基中被分离得到，在后期纯化中，纯化是逐级提高培养基浓度时可以在浓度为1/20的培养基生长，第二次纯化无法生长，转移至略高浓度梯度营养水平可纯化出来，说明在实验过程中部分菌株出现驯化情况。武凤霞等^[21]通过将微生物接种于不同浓度培养基上分离培养，发现培养基浓度会影响微生物分离，在实验中，部分菌株出现驯化现象，与本实验结果一致。

本次研究经种类鉴定分属于4个门6个纲21个目29个科58个属221个种，属于Actinomycetia的Streptomyces为主导优势属，分属于43个种，占总种的19%；Bacilli的Bacillus为第二优势属，分属于22个种，占总种的10%；属于Actinomycetia的Nocardiopsis为第三优势属，分属于20个种，占总种的9%。Streptomyces和Nocardiopsis皆属于Actinomycetia的放线菌，放线菌在干旱环境中作为优势菌株不足为奇，因为它们具有很强的产孢能力，孢子耐受极端环境能力强，且具有次生代谢物合成和多重紫外修复机制^[22-24]。芽孢杆菌属细菌广泛存在于极地、沙漠和盐湖等极端环境中，参与碳、氮循环，常被应用于生物肥料、生物降污、种子保护和生物防治等方面^[25]，与其他沙漠微生物群落分布类似，芽孢杆菌属在我国其他类似环境的沙漠地区，如毛乌素沙地曾分离出大量芽孢杆菌^[26]。芽孢杆菌还能够产生芽孢，能抵御恶劣气候、耐盐耐热等^[27]。塔克拉玛干沙漠的优势菌种体现了环境对菌种淘汰选择的同时，也体现了这些微生物对高温、干旱、高盐碱等极端环境的强大适应性。

通过向分离培养基添加诺氟沙星，共分离获得80个新种2个新属，其中分离于田县沙土样品获得19株疑似新菌种，分离阿拉尔市沙土样品获得5株疑似新菌株，1株疑似新菌属，分离洛浦县沙土样品获得23株疑似新菌株，分离且末县沙土样品获得16株疑似新菌种，1株疑似新菌属，分离沙雅县沙土样品获得16株疑似新菌种。添加诺氟沙星作为抑制剂，有利于抑制生长速度快的常见微生物，分离到更多生长缓慢的稀有微生物。本次研究共获得43株诺氟沙星抗药株，其中Streptomyces占34.88%；获得15株诺氟沙星中等耐药株，其中Streptomyces占26.66%，表明Streptomyces的菌株大多具有耐药性。链霉菌是一种来源于土壤的革兰氏阳性菌，具有复杂的生活周期和次级代谢途径，能够产生多种药用和农用抗生素以及多种具有生物活性的次级代谢产物。在长期的进化中，链霉菌必须积累适当的抗生素耐药基因和相应的调节基因，以保护自身免受致命代谢物的破坏^[28]，与本研究结果相符。虽然本次研究获得具有耐药性的菌株占总体的29.41%，但培养基添加诺氟沙星的浓度仅为0.015 μg/mL，远低于采用的诺氟沙星药敏片(10 μg)剂量。结果表明，添加诺氟沙星有利于筛选更多的耐药性菌株，早在20世纪50年代初，人们就发现抗生素的耐药水平与抗生素的产量之间有一定的联系，并把提高耐药水平作为获得抗生素高产菌株的途径之一^[29]，该方法可为高效挖掘活性菌株奠定基础、抗生素环境污染的降解和抗菌新药的研发策略提供了新的思路和途径。

沙漠样品中的矿物质、有机物和微生物往往吸附于沙粒表面和内部缝隙，难以充分释放，本次研究对沙漠样品进行精细研磨，可以确保各种成分和微生物充分释放和分离。采用稀释传统分离培养基营养浓度，更有利于提高寡营养环境微生物的可培养性。本研究未采用传统的稀释涂布分离法，采用无菌丝绒布拍撒法减少了水对干旱环境微生物的影响。通过优化改良传统的微生物分离方法，从塔克拉玛干沙漠样品中分离获得了丰富的微生物资源及大量潜在新物种。

本次研究添加诺氟沙星于多种稀释浓度的分离培养基中，分离培养塔克拉玛干沙漠微生物，共分离获得246株菌，分属于4个门6个纲21个目29个科58个属221个种，优势菌门为Firmicutes和Actinobacteria；优势菌纲为是Bacilli、Actinomycetia；优势菌目为Bacillales、Streptomycetales；优势菌科为Bacillaceae、Streptomycetaceae；优势菌属为Streptomyces、Bacillus和Nocardiopsis。其中有80株菌最大相似度低于98.65%为疑似潜在新物种，其中有2株菌最大相似度低于95.00%为疑似潜在新属。表明塔克拉玛干沙漠具有丰富的可培养微生物资源，对丰富微生物资源库具有重大意义。虽与其他环境相比，塔克拉玛干沙漠营养物质匮乏、环境气候极端，可培养细菌生物量偏小，但可培养的细菌多为抗性、耐性强的极端微生物^[30-31]。该地区特有的微生物资源、功能微生物和新种资源丰富，为防治沙漠化、开发微生物菌剂等研究奠定了物质基础。本研究结果对塔克拉玛干沙漠的自然生态保护以及极端微生物资源的应用具有重要意义。