温故知新｜足月妊娠母胎界面与系统免疫中 NK 细胞表型和 T 细胞变化的研究

学术 2024-09-13 17:01 北京

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本文发表于《中华围产医学杂志》2006年第5期

引用格式：周建军,胡娅莉,侯亚义,等. 足月妊娠母胎界面与系统免疫中NK细胞表型和T细胞变化的研究[J]. 中华围产医学杂志,2006,9(05)：309-314. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2006.05.007

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周建军胡娅莉侯亚义王志群郝莎戴毅敏李洁

基金项目:江苏省卫生厅基金重点资助项目(K200515)

作者单位:210008 南京,南京大学附属鼓楼医院妇产科(周建军、胡娅莉、王志群、戴毅敏、李洁);南京大学医学院(郝莎、侯亚义)

通信作者:胡娅莉

【摘　要】

目的探讨足月妊娠母胎界面及系统免疫中 NK、T 细胞的免疫状态变化及其相互关系。

方法对10例正常足月妊娠妇女,剖宫产同时采集子宫底蜕膜、外周静脉血,通过流式细胞技术,检测其 NK 细胞亚群、NK 细胞表面受体 CD69、CD94及 Th1/Th2免疫状态。

结果底蜕膜和外周血中各指标结果为:CD56brightCD16- 含量:(18.72±17.73)%和(0.28±0.18)%;CD56+ CD69+ 亚群:(34.98±19.79)% 和 (3.33±1.27)%;CD56brightCD94+ 含量:(15.94±13.19)% 和 (1.17± 1.19)%;CD56+CD16-/CD56+CD16+ 比值:(2.30±2.25)和(0.34±0.28);CD56+ CD69+/CD56+ CD94+ 比值:(1.21±0.66)和(0.28±0.12),差异均有统计学意义(P<0.01);底蜕膜中 Th1、Th2、 Tc1细胞含量及 Th1/Th2、Tc1/Tc2比值与外周血均无显著性差异(P>0.05);子宫底蜕膜中自然杀伤细胞(uterine natural killer cell,uNK 细胞)亚群,uNK 细胞表面受体 CD69、CD94,Th1/Th2免疫状态与外周血均无相关性(P>0.05)。

结论与维持妊娠免疫耐受关系极大的uNK 细胞,在足月妊娠底蜕膜中保持相对的活化状态,同时uNK、T细胞的变化独立于外周血中的免疫状态。

【关键词】 妊娠;免疫耐受;杀伤细胞,天然;T淋巴细胞

妊娠产物对于母体来说是半异己的同种移植物,母体免疫系统能否识别并耐受胚胎及胎儿抗原, 直接影响妊娠的建立与维持。目前,关于妊娠免疫的研究侧重在妊娠早期,而晚期妊娠或足月妊娠母- 胎界面免疫状态,以及局部和系统免疫状态间关系的研究尚缺乏,本研究对正常足月妊娠子宫底蜕膜自然杀伤细胞(uterine natural killer cell,uNK cell) 亚群、uNK 细胞表面受体 CD69、CD94及 Th1/Th2 模式进行了探讨,并与外周血中 NK 细胞、T 细胞比较,现将结果报告如下。

资料和方法

一、研究对象

随机选取我院产科2005年9月到2005年11 月,因臀位、引产失败、社会因素等原因行剖宫产的单胎足月正常妊娠妇女10例,孕妇平均年龄(25.3 ±2.6)岁,孕周(40.0±1.1)周。既往月经规则,排除胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、早产、产前发热、妊娠高血压疾病、妊娠肝内胆汁淤积症、系统性红斑狼疮、风湿病、慢性高血压、肾炎、糖尿病、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、再生障碍性贫血等病理妊娠。

二、方法

1. 标本来源:在行剖宫产前30 min抽取外周血2ml,在剖宫产胎盘娩出后,刮取胎盘附着中央处的底蜕膜组织约1g。

2. 底蜕膜及外周血淋巴细胞的分离:底蜕膜细胞采用胶原酶Ⅳ消化分离法分离,底蜕膜及外周血淋巴细胞采用 Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液分离[1]。

3. 底蜕膜及外周血 NK 细胞表型 CD56、CD16、 CD69、CD94的测定:采用流式细胞术双色免疫荧光分析法进行分析[1]。其中藻红蛋白荧光素(PE)-白细胞分化抗原分化簇(CD)56单克隆荧光抗体(PECD56)购自美国 Ebioscience公司,异硫氰酸荧光素 (FITC)-CD16单克隆荧光抗体(FITC-CD16)、FITCCD69、FITC-CD94抗体均购自美国 Caltag公司,抗体浓度均为10μl抗体/1×106 细胞。

4. 底蜕膜及外周血 Th1/Th2模式的测定:采用流式细胞术三色免疫荧光分析法进行分析[2]。其中 PE-Cy5-CD3、FITC-CD8、PE-IFN-γ和 PE-IL-4 抗体均购自美国 Caltag公司,抗体浓度均为10μl 抗体/1×106 细胞。

5. 主要检测指标:底蜕膜及外周血淋巴细胞中NK 细胞 CD56+ 、CD16+ 、CD56+ CD16- 、CD56+ CD16+ 、CD56- CD16+ 、CD56brightCD16- 、CD56dim CD16+ 、CD56+ CD69+ 、CD56dim CD69+ 、CD56bright CD69+ 、CD56+ CD94+ 、CD56dim CD94+ 、CD56bright CD94+ 细胞百分比,NK 细胞亚群比值 =CD56+ CD16+ (%)/CD56+ CD16- (%),CD56+ CD69+ (%)/CD56+CD94+ (%)比值,底蜕膜及外周血 Th 细胞中 Th1、Th2百分比及Tc细胞中 Tc1、Tc2细胞百分比,Th1(%)/Th2(%)、Tc1(%)/Tc2(%)比值。

三、统计学方法

结果以x±s表示,用SPSS12.0软件对数据进行配对t检验,还进行了 Pearson相关性分析。

结果

一、底蜕膜及外周血中 NK 细胞亚群含量比较

足月妊娠底蜕膜淋巴细胞中 uNK 细胞的总量、CD56+CD16- 亚群、CD56brightCD16- 亚群含量较外周血显著性增加 (P <0.01),同时 CD56+ CD16-/CD56+ CD16+ 比值也显著性增加 (P = 0.022)。但是底蜕膜淋巴细胞中 CD56+ CD16+ 亚群、CD56dimCD16+ 亚群及 CD56- CD16+ 亚群含量与外周血中无显著性差异(P>0.05)。结果见图1、表1。

二、底蜕膜及外周血中 NK 细胞表面受体 CD69、CD94含量的比较

足月妊娠底蜕膜淋巴细胞中 CD56+ CD69+ uNK 细胞、CD56brightCD69+ 亚群、CD56dimCD69+ 亚群、CD56+CD94+uNK 细胞及CD56brightCD94+ 亚群含量较外周血中显著性增加 (P <0.01),同时 CD56+CD69+/CD56+CD94+ 比值也显著性增加(P =0.002)。但是底蜕膜中 CD56dimCD94+ 亚群含量与外周血中无显著性差异(P>0.05)。结果见图1、表1。

三、底蜕膜及外周血中 Th1/Th2模式的比较

足月妊娠底蜕膜中 Th1 细胞、Th2 细胞、Tc1 细胞含量与外周血中均无显著性差异(P>0.05), 同时 Th1/Th2、Tc1/Tc2比值与外周血中也无显著性差异(P>0.05),但是底蜕膜中 Tc2细胞含量较外周血中显著性增加(P=0.04)。结果见图 2、表2。

四、底蜕膜及外周血 NK 细胞亚群、NK 细胞表面受体 CD69、CD94及 Th1/Th2模式相关性分析 (见表1、表2)

足月妊娠底蜕膜中 uNK 细胞亚群,uNK 细胞表面受体CD69、CD94,Th1、Th2、Tc1、Tc2细胞含量及 Th1/Th2、Tc1/Tc2的比值与外周血均无相

讨论

关于妊娠免疫的研究侧重在妊娠早期,研究表明uNK 表型和 Th1、Th2平衡状态与不明原因习惯性流产、胚胎停止发育等妊娠早期并发症有关[3-5]。而还有一些常发生在妊娠晚期的产科并发症如子痫前期、子痫、胎儿生长受限,可能与免疫异常有关。故需要研究正常晚期妊娠或足月妊娠母-胎界面免疫状态,以及这种状态和系统免疫的关系,以便为妊娠晚期并发症免疫状态的研究奠定基础。本研究通过同时检测足月妊娠子宫底蜕膜和外周血中 NK 细胞亚群、NK 细胞表面受体 CD69、CD94、T 细胞胞内细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,了解正常妊娠晚期母胎界面和母体外周血中 NK、T 细胞的免疫状态及其相互关系。

一、足月妊娠底蜕膜和外周血 NK 细胞亚群的变化及相互关系

NK 细胞约占人外周血淋巴细胞的15%,主要参与非特异性免疫反应,根据 NK 细胞表面 CD56分子表达的多少,NK 细胞可分为 CD56brightCD16- 和 CD56dimCD16+ 亚群,各有其独特的功能及不同的免疫效应。CD56dim CD16+ NK 细胞亚群比 CD56brightCD16- 亚群有更高的细胞毒活性及更多的免疫球蛋白样 NK 受体和 Fcγ 受体 (CD16);而 CD56 bright CD16- 亚群在单核细胞的刺激下能够产生大量的细胞因子,在外周血中 90% 的亚群属于 CD56 dim CD16+ 。近年来研究发现妊娠早期子宫蜕膜中有大量 NK 细胞,又称子宫 NK 细胞(uNK 细胞),约占蜕膜淋巴细胞的70%,其中主要的细胞亚群是 CD 56 bright CD16- ,动物试验显示 CD56 bright CD16- uNK 细胞分泌的细胞因子对调节妊娠早期滋养细胞的侵蚀及胎盘血管床生理性重铸有着重要的作用。虽然对正常妊娠中晚期外周血中 NK 细胞的研究发现,其数量较非孕妇女显著性减少[6],但对足月妊娠母胎界面 uNK 细胞亚群的研究仅见 Sindram-Trujillo的报道[7,8],而足月妊娠母胎界面 uNK 细胞亚群与外周血 NK 细胞亚群关系的研究未见报道,这可能与妊娠晚期底蜕膜取材困难有关。本研究于剖宫产时刮取正常足月妊娠底蜕膜, 同时抽取外周血,检测 NK 细胞表面 CD56、CD16 的水平,发现足月妊娠底蜕膜中 CD56+ uNK 细胞约占淋巴细胞的47.83%,提示在足月妊娠底蜕膜仍然存在大量 uNK 细胞,其中 CD56+ CD16- 亚群占 29.46%,CD56+ CD16+ 占 18.37%,这与 Sindram-Trujillo等[7]的实验结果基本一致;与足月妊娠外周血中 NK 细胞亚群相比,CD56+CD16+ 亚群无明显变化,而 CD56+CD16- 亚群显著性地高于外周血,提示 uNK 细胞 CD56+ CD16- 亚群可能较 CD56+CD16+ 亚群对维持足月妊娠免疫耐受起着更重要的作用。另外本试验显示 uNK 细胞亚群与外周血中 NK 细胞亚群无相关性,提示底蜕膜中 uNK 细胞亚群的变化独立于系统免疫状态。

二、足月妊娠底蜕膜和外周血中 NK 细胞表面受体 CD69、CD94的变化及相互关系

NK 细胞表面表达多种非抗原特异性受体,如 C型凝集素超家族(CL-SF)和免疫球蛋白超家族 (Ig-SF)等,NK 细胞主要依赖这些受体与相应配体结合以实现其生物学功能。NK 细胞能表达 CD69、 CD94分子,两者均是白细胞Ⅱ型完整膜糖蛋白,属于 C型凝集素超家族。CD69能介导各种细胞反应如:增殖、激活淋巴细胞产生细胞因子、诱导 NK 细胞的杀伤细胞活性,属于杀伤活化性受体;而 CD94属于杀伤抑制性受体,CD94与 NKG2形成的二聚体可以与滋养细胞非经典 MHCⅠ类分子 HLA-E 结合,传导抑制信号,能阻止 NK 细胞溶解滋养细胞。NK 细胞在静止状态不表达 CD69。

本试验结果显示在正常足月妊娠外周血中 CD56+CD69+ NK 细胞占 3.33%,提示外周血中 NK 细胞基本处于静止状态。当IL-2,IL-7,IL-12, IFNα、PMA 和 CD16交联可启动 NK 细胞活化,诱导 CD69的表达,CD69交联可启动 NK 的细胞毒活性,因而 CD69被认为可能是活化的细胞毒淋巴细胞的靶细胞受体。研究显示 uNK 细胞的活性与 CD69的表达相关,在月经增生期子宫内膜 uNK 细胞 CD69表达增加,而在妊娠早期表达下降。本试验显示在正常足月妊娠底蜕膜中 CD56+CD69+ NK 细胞占34.98%,较外周血中显著性增加,可能原因是蜕膜局部与半异己的同种移植物胚胎直接接触, 同时由于uNK 细胞、T 细胞及巨噬细胞等在局部微环境中分泌的各种细胞因子如:IL-2,IL-7,IL-12, IFNα等激活了 uNK 细胞表达 CD69,进而激活 uNK 细胞的杀伤活性。体外试验表明 NK 细胞的抑制性受体 CD94可以通过阻断 CD69活化细胞外信号调节激酶(ERK)而封闭 CD69激活的 NK 细胞杀伤活性[9]。试验结果显示正常晚期妊娠底蜕膜中 CD56+CD94+uNK 细胞占31.09%,也较外周血显著性增加,可能原因是底蜕膜中 CD56+ CD69+ uNK 大量激活,进而使 uNK 表达 CD94也相应增加,从而抑制 uNK 的过度激活,其中主要是 CD56brightCD94+ 亚群显著性增加,提示可能是这一亚群在抑制 CD56+CD69+uNK 起着重要作用。不过,蜕中 CD56+ CD69+/CD56+ CD94+ 比值为 1.21,较外周血明显增高,提示底蜕膜中 uNK 处于相对活化状态。本试验还显示,底蜕膜及外周血 NK 细胞表面受体 CD69、CD94的含量无相关性,所以检测外周血中的 NK 细胞表面受体 CD69、CD94 的含量不能反映底蜕膜中的 uNK 细胞表面受体 CD69、CD94的状态,底蜕膜中 uNK 细胞各种受体的表达与底蜕膜局部免疫状态有关,独立于外周血系统免疫状态。

三、足月妊娠底蜕膜和外周血中 Th1/Th2模式的变化及相互关系

近年的研究发现根据产生细胞因子类型的不同,CD4+ 辅助 T 细胞(Th细胞)可分为 Th0、Th1、 Th2和 Th3四种亚群。Th0是初始(naive)T 细胞, 接受刺激后可转变为 Th1或 Th2。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2,它们有利于 B细胞产生有调理作用的抗体(IgG、IgA)和与补体相结合的抗体(IgM、 IgG),促进巨噬细胞的活化及引起 T 淋巴细胞介导的细胞毒作用和细胞免疫;Th2细胞主要分泌IL- 4、IL-5等,它们引起较强的抗体反应、介导体液免疫。CD8+ T 细胞可分为 Tc0、Tc1、Tc2等,它们的具体作用尚不明确。在正常机体内,Th1/Th2网络维持着动态平衡,当 Th1/Th2平衡失调时,即某一亚群功能增强,另一亚群功能减弱,称为“Th1/Th2 漂移”。目前研究发现正常妊娠时母体外周血中存在 Th2免疫漂移,而多种病理妊娠如子痫前期、不明原因的习惯性流产时母体外周血及胎盘中的细胞因子可能向 Th1免疫漂移[10];但是也存在一些相反结论,可能与实验方法不同或检测对象不同有关。本试验采用流式细胞仪三色分析法检测 T 细胞胞内细胞因子IFN-γ、IL-4以确定 Th1/Th2模式的状态,该方法与 ELISA、原位杂交等方法相比,具有稳定重复性好、相对快速并能准确定等优点[11]。本研究显示足月妊娠底蜕膜及外周血中 Th1、Th2、Tc1细胞的含量及 Th1/Th2、Tc1/Tc2 的比值均无显著性差异,两者亦无相关性,提示母胎界面 Th1、Th2的免疫状态亦独立于系统免疫,所以在研究妊娠期 Th1/Th2状态时,需同时考虑母胎界面免疫及系统免疫中 Th1/Th2免疫状态。

综上所述,本研究通过对正常足月妊娠母胎界面uNK 细胞亚群、uNK 细胞表面受体 CD69、CD94 及 Th1/Th2模式的研究发现:母胎界面 uNK 细胞处于相对活化状态,同时母胎界面 uNK 细胞、T 细胞的免疫状态独立于外周血系统免疫。

参考文献

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