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1、温故知新｜孕母子痫前期、子痫对新生儿脑损伤及神经发育的影响
【摘 要】
新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischem ic encephalopathy,HIE)是新生儿常见疾病,致死、致残率较高。现代药理学研究表明沙棘总黄酮具有阻滞钙离子内流、清除自由基、抗生物膜过氧化等作用。因此,本研究以新生大鼠缺氧缺血性脑病模型,观察沙棘总黄酮对神经细胞的保护作用。
1.仪器设备及药物:(1)常压缺氧舱:自制 30cm× 30cm×50cm 塑料容器,两端各有一直径为1cm 小孔,分别为进气孔和出气孔,容器底层铺有碱石灰以吸收二氧化碳及水分;(2)CY-100 型便携式数字测氧 仪:测氧范围 0~ 100%,浙江省建德市利达仪器厂生产;(3)JEM-1230 型透射 电子显微镜 (日本电子公司);(4)丹参注射液:丹参含量 2g/ml,四川升和制药公司,批号为98012;(5)沙棘总黄酮: 河北神兴集团沙棘药业有限公司。使用前用磷酸盐缓冲液 (pH=7.4)配制成所需浓度。
2.动物模型制备及实验分组:7日龄[1] Wistar大鼠(兰 州大学基础医学院动物实验室提供)40只,体重12~15g, 雌雄不限。2%利多卡因局部麻醉,行颈部正中切口。随机取32只大鼠结扎左颈总动脉后立即 放入缺氧舱中,吸入8%氧气和92%氮气的混合气体,测氧仪监测氧浓度,2h后取出,制成 HIE模型后随机分为4组:模型对照组8只;生理盐水组8只;丹参组8只;沙棘总黄酮组8只。丹参组、沙 棘总黄酮组及生 理盐水组分别予腹腔内注射丹参注射液 4ml/(kg·d)、沙棘总黄酮400mg/(kg·d)×3次、生理盐水4ml/(kg·d)×3次,模型对照组不注射药物;其余8只大鼠作为假手术组,仅分离左颈总动脉,不结扎也不作其他 处置。各组均于术后72h后取材。
3.取材方法:将大鼠麻醉,剖开胸腔并暴露心脏,切开右心室,穿刺 针刺入左心室,用肝素化的生理盐水常规灌洗[2]后,取左右脑分别称重并比较;取左侧大脑固定、石蜡包埋,在中1/3 冠状面连续4μm 切片用于检测脑组织病理变化和神经元凋亡情况;另取大鼠左脑海马部位的脑组织制成电镜标本,观察其超微结构变化。
4.观察指标:(1)脑重减轻程度:缺氧缺血(左)侧大脑半球重量减轻程度采用脑重减轻百分比评估,即(右脑重- 左脑重)/右脑重×100%。(2)神经元凋亡的检测:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记 (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling, TUNEL)法。TUNEL试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。细胞核染成蓝紫色为阳性细胞,选取脑皮质及海马,400倍光镜下随机计数5个视野500个细胞中阳性细胞数并取平均数。(3)脑病理变化:采用 HE 染色观察脑组织病理变化并进行病理量化评分[3],“变性”指组织嗜伊红染色增强或呈细网状改变;“坏死”指组织为小圆形空泡密集或小圆形空泡呈相互融合,组织结构模糊或消失;“胶质细胞增生”主要指小胶质细胞的灶性增生;“点状”指病变涉及单个散在细胞;“灶性”指病变累及<100个细胞;“片状”指病变 累及> 100个细胞;“弥漫性”指病变累及较大范围。(4)在 电镜下观察脑组织超微结构变化,并比较各组神经元坏死及凋亡情况。
5.统计学处理:应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组均数比较采用单因素方差分析及q检验进行两两比较。
1.各组脑重减轻程度的比较:模型对照组和生理盐水组脑重减轻程度重于假手术组(P<0.01);丹参组和沙棘总黄酮组脑重减轻程度轻于模型对照组(P<0.01)。见表1。
2.各组神经元凋亡检测结果:模型对照组和生理盐水组左侧皮 质、海马凋亡细胞数明显高于假手术组 (P< 0.01);沙棘总黄酮组和丹参组左侧皮质、海马凋亡细胞数均明显低于模型对照组及生理盐水组(P<0.01)。见表2。
3.各组脑组织病理变化的比较:HE染色及病理量化评分结果见表3。模型对照组和生理盐水组脑组织病理量化评分高于假手术组(P<0.01);沙棘总黄酮组和丹参组脑组织病理量化评分明显低于模型对照组及生理盐水组(P< 0.01)。
4.脑组织超微结构的改变:电镜下,模型对照组和生理盐水组神经元呈现明显的凋亡细胞特征,可见明显的核膜皱缩、泡状突起,甚至破裂,核浆外漏,核不规则,染色质聚集成小块状、边集,胞质极度致密,内质网肿胀,可见凋亡小体。而沙棘总黄酮组和丹参组神经元凋亡、坏死情况较模型对照组和生理盐水组明显减轻。
研究表明,脑缺氧缺血损伤一般经历原发性损伤和继发性损伤(又称为再灌注损伤)两个阶段,一般间隔为30min~72h不等。目前研究证实,在继发性损伤中氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内 Ca2+ 增多占重要地位,三者的中心环节是细胞内钙平衡的紊乱;继发性损伤是引起新生儿神经系统损伤的最主要原因之一[4]。
沙棘总黄酮(又名醋柳黄酮)是从我国传统中药沙棘中提取的沙棘有效成分之一。近年来研究证实,沙棘总黄酮具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗氧化、 抗衰老、抗辐射、抗菌、抗病毒及增强机体免疫功能等广泛的药理功效。已被临床应用于心绞痛、缺血性心肌病、心律失常、脑梗死、高血压病等的治疗。有研究报道沙棘总黄酮能明显减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤程度,明显提高心肌组织超氧化物歧化酶活性,并减少丙二醛的产生,对心肌缺血再灌注损伤可产生明显保护作用,这一作用可能与沙棘总黄酮可提高氧自由基清除酶活性及抑制脂质过氧化反应有关[5]。沙棘总黄酮可通过对电压依赖性钙通道和受体型钙通道双重抑制作用而降低血管平滑肌细胞内游离钙水平,维持细胞内的钙稳态[6]。沙棘总黄酮还可使急性血瘀模型大鼠全血低切黏度、血浆比黏度、血浆纤维蛋白原浓度、血沉、红细胞压积、红细胞聚集指数及红细胞刚性指数明显降低,表明沙棘总黄酮具有化瘀通脉作用[7]。此外有研究显示注射沙棘总黄酮后能明显提高小鼠在低压低氧情况下的存活率,对异丙肾上腺素增加心肌耗氧也有明显对抗作用,表明沙棘总黄酮有明显的抗缺氧能力[8]。本研究证明:缺氧缺血新生大鼠腹腔注射沙棘总黄酮后脑重减轻程度(新生大鼠的脑组织正处于迅速生长阶段,脑半球重量的降低可作为脑损伤的一个指示剂[9])明显低于模型对照组,说明沙棘总黄酮可能在对抗脑损伤、减轻脑水肿方面起到一定作用;通过 HE、 TUNEL染色及电镜观察显示:沙棘总黄酮组大鼠脑神经元凋亡数及变性、坏死程度均较模型对照组为轻,考虑可能与沙棘总黄酮清除氧自由基、维持钙稳态和增强脑细胞对缺氧的耐受能力等有关。总之,沙棘总黄酮对新生大鼠缺氧脑损伤具有保护作用,但具体作用机制尚未完全阐明。相信随着沙棘总黄酮有效成分的不断纯化和研究的深入,它在缺氧缺血性疾病中的应用前景将更加清晰。
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