温故知新​|色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用

学术   2024-09-09 17:02   北京  

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本文发表于《中华围产医学杂志》2006年第6期
引用格式:张淑莲,石文静,陈超. 色素上皮衍生因子对新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用[J]. 中华围产医学杂志,2006,9:(06):381-384. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2006.06.007

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张淑莲   石文静   陈超
作者单位:200032 上海,复旦大学附属儿科医院新生儿科 
通信作者:陈超 







【摘 要】


目的   探讨色素上皮衍生因子(pigment epitheliuderived factor,PEDF)对高氧诱导 的新生小鼠视网膜病变新生血管的抑制作用。 

方法    选取7日龄 C57BL/6J新生小鼠吸75%高氧 5d后返回空气制备早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)的小鼠模型。通过对模型组 (n=26)和模型对照组(n=26)小鼠视网膜比较,观察吸氧对视网膜血管的影响。治疗组(n=112):采用不同剂量和注药次数给 ROP小鼠右眼玻璃体内注入 PEDF,左眼作为自身对照,在生后17d各组 取材做视网膜铺片和切片,对视网膜新生血管进行形态学观察和定量研究。 

结果   ROP小鼠在生 后第12天和14天右眼注入两次 PEDF后,第17天时计数突破视网膜内界膜的细胞核数,1μg组左右眼细胞核数分别是(39.43±3.28)个和(13.51±2.05)个 (P=0.000);2μg组左右眼细胞核数分别 是(48.40±6.24)个和(11.80±1.74)个(P=0.000)。血管形态和定量结果均显示眼内注射 PEDF 后新生血管形成明显减少。以2μg作为注射 PEDF剂量,单次注药无效,二次和三次眼内注药有效果。 

结论   玻璃体内注入 PEDF能有效抑制视网膜新生血管的生长,同时不影响正常血管的发育, 可能成为防治 ROP有效的血管抑制因子。

【关键词】   眼蛋白质类;神经生长因子;舍平类;视网膜病,早产儿;视网膜新生血管化 





早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity, ROP)是一种增殖性视网膜病变,新生血管的形成在其发病中起主导作用[1]。色素上皮衍生因子 (pigment epithelium-derived factor,PEDF)在1989 年由 Tombran-Tink等[2]首次报道,它是丝氨酸蛋白酶抑制超基因家族的一员,是目前已知的最强有力的天然存在于眼内的血管抑制因子,能广泛拮抗多种促进血管生长因子的作用,因此成为防治 ROP 最有潜力的因子。本实验采用高氧诱导的视网膜病变的新生小鼠模型[3],玻璃体内注入 PEDF,观察其对视网膜新生血管的抑制作用。 

材料和方法
  一、实验动物及分组 
选取7日龄健康 C57BL/6J新生小鼠164只, 由中国科学院上海实验动物中心提供,雌雄不限,与母鼠一起饲养至适当日龄。实验分为模型组、模型 对照组及治疗组。模型组:26只制备的 ROP 模型小鼠;模型对照组:26只新生小鼠在空气中饲养不给药。治疗组112只 ROP模型小鼠注射不同剂量和次数的 PEDF。
  1.ROP小鼠模型制备:将7日龄新生小鼠连同哺乳母鼠一同置入密闭氧箱吸入高氧5d,再返回正常空气中饲养,制备新生小鼠视网膜病变模型。氧 箱氧气浓度控制在 (75±2)%,温度控制在 (23± 2)℃,每两天更换垫料,添加饲料、水及替换母鼠。
  2. 注药方法:治疗组小鼠腹腔注射 Avertin(20 μl/g)麻醉,在立体显微镜下使微注射器针头透过结膜在鼻上或颞上象限距角膜缘后2mm、以40°~60° 朝向赤道区刺入玻璃体腔,将注射器内的 PEDF(购于美国BioProducts MD公司)注入,并停留约1min 后拔针。均以右眼为注药眼,左眼作为自身对照眼。 
3. 治疗分组及给药方案:根据 PEDF 剂量、注入次数不同,对治疗组(n=112)进行分组,同时设立两个对照组。 
不同给药剂量:给 ROP模型小鼠在第12、14天右眼注入两次 PEDF,采 用三种剂量,0.5 μg (n=14)、1μg(n=14)、2μg(n=14),观察相同时间点相同 注药次数,不同剂量 PEDF 发挥作用的情况。
  不同给药次数:以2μg作为注药剂量,ROP模型小鼠在第12(n=14)或 14 天时(n=14)单次注药;第12、第14天两次注药(2μg剂量组的14只小鼠);第12、第14、第16天三次注药(n=14),观察不同注药次数 PEDF对视网膜新生血管的影响。 
治疗对照组:ROP模型治疗对照组(n=14):给 ROP小鼠模型在第12、第14天右眼注入1μl磷酸缓冲液(PBS);非模型治疗对照组(n=14):空气中 饲养的小鼠在第12、14天右眼注入2μgPEDF,观察视网膜新生血管的形成情况。
二、观察指标 
1. 视网膜血管形态:模型组及模型对照组在第 12、14、17天取材,治疗组每亚组取6只小鼠,注药后在第17天取材。小鼠经灌注后,多聚甲醛中固定 过夜,左右眼分开,剥离的视网膜漂洗后 ADP染色制成视网膜铺片,观察视网膜血管的形态。
2. 视网膜血管内皮细胞核计数:模型组、模型对照组及治疗组,每组取8只小鼠在第17天处死, 摘取眼球制作石蜡切片,以平行于角膜至视乳头的矢状位平面的方向连续切片,切片厚度6μm,每间隔30μm 取一张切片,每只眼共取10张切片,计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,定量研究新生血管形成情况。 
三、统计学方法
使用统计分析软件 SPSS12.0 对数据进行分析,计量资料用均数±标准差(췍x±s)表示,采用非配对t检验方法比较模型组和模型对照组突破视网膜 内界膜的新生血管内皮细胞核数;治疗组采用配对t检验方法比较左右眼突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,左眼与右眼突破视网膜内界膜的 细胞核数的差值作为评价治疗效果的指标,各组间比较采用方差分析并进行两两比较。 

结 果 
一、高氧对视网膜血管的影响 
1. 视网膜铺片观察血管形态:模型组与模型对照组比较,小鼠在12d(出氧箱当天)时,中央部视网 膜可见大片无灌注区,周边部可见少量血管结构;在 14d时,在灌注区和无灌区交界出现新生血管,结构紊乱,自视盘发出的血管明显扩张、迂曲;在17d 时,中央无灌注区减少,可见大量新生血管形成,结构及分布紊乱,两层血管网结构辨别不清。
  2. 视网膜血管内皮细胞的定量结果:模型组与模型对照组相比可见较多突破内界膜的血管内皮细 胞核,有的单独出现,有的成簇出现。模型组和模型 对照组平均每张切片中新生血管内皮细胞核数分别为(42.91±3.53)个和(1.63±0.30)个,两组相比差异有统计学意义(t=-11.653,P=0.000);模型组 小鼠左右眼新生血管内皮细胞核数分别是(40.41± 4.94)个和(45.40±5.22)个,差异无统计学意义(t =0.694,P=0.499)。 
二、PEDF对视网膜新生血管的作用
1. 不同给药剂量结果:新生血管形态学改变: 0.5μg组小鼠左右眼均见大量新生血管形成,血管 结构紊乱伴血管阻塞,丧失正常的血管两层结构; 1μg组注药的右眼比左眼血管减少,结构也较清晰; 2μg组注药的右眼新生血管较左眼明显减少,结构 清楚,可见两层血管结构。
新生血管定量结果:计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数,0.5μg组左右眼比较差异无统计学 意义,1μg和2μg组注药右眼均明显低于左眼,差异有统计学意义。同时比较右眼较左眼减少的细胞核数,三种剂量组组间比较差异有统计学意义(P= 0.000),0.5μg组分别与1μg和2μg组比较差异有统计学意义(P 值均为0.000),但1μg和2μg组 比较差异无统计学意义(P=0.129)。见表1。


2. 不同给药次数结果:新生血管形态学改变: 在12d或14d单次注药,左右眼比较差异无统计学 意义,均见大量新生血管,血管结构紊乱;二次和三 次注药,注药的右眼比左眼新生血管明显减少。 
新生血管定量结果:计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,第12或14天单次给药的 两组,左右眼比较差异无统计学意义(P>0.05);二次和三次注药的两组,右眼细胞核数明显低于左眼, 差异有统计学意义。比较右眼较左眼减少的细胞核数,四个实验组组间比较差异有统计学意义(P= 0.001),但两次注药组与三次注药组相比,差异无统计学意义(P=0.596)。见表2。
  3. 治疗对照组:新生血管形态学改变:ROP模 型治疗对照组小鼠注入 PBS,左右眼比较视网膜新生血管无差异,均可见大量新生血管形成;非模型治 疗对照组小鼠眼内注入 PEDF 后,左右眼比较差异无统计学意义,均为发育良好的视网膜血管,可见两层视网膜血管结构。 


新生血管定量结果:计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数,ROP模型治疗对照组小鼠左右眼分别是 (46.73±1.37)个和 (52.08±7.66)个(t= -0.704,P=0.504);非模型治疗对照组左右眼分别是(1.09±0.21)个和 (1.59±0.37)个(t= -1.680,P=0.137),两组左右眼比较差异均无统计学意义。 

讨 论
 一、高氧诱导视网膜新生血管的形成 
视网膜铺片可直接观察血管的发育及形态,能直观反映视网膜血管的变化,石蜡切片计数突破视 网膜内界膜的血管内皮细胞核数可对新生血管进行定量,二种方法结合能全面反映视网膜血管的发育 及高氧对新生血管的影响。高氧诱导的视网膜小鼠模型,制备简便、可重复性高,可以观察到视网膜发育的全过程。实验中观察到将7日龄新生小鼠置于高氧环境中,高浓度氧可刺激视网膜血管产生可逆性痉挛收缩,持续高氧使小血管闭塞,形成视网膜无灌注区并进行性扩大, 当返回正常环境中,无灌注区缺血缺氧,2天后就可 观察到新生血管的生长,并在第17天时达到异常血管形成的高峰,类 似于 ROP 的视网膜病理改变。而此时计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数模型组比模型对照组显著增多,实验结果显示吸氧对左右眼影响也是相同的,因此可以对左右眼给予不同干预,形成自身对照,控制相同实验条件,减少误差。 
二、PEDF抑制视网膜新生血管的生长
有报道将含有 PEDF 基因片断的腺病毒相关病毒(AAV-PEDF)注入眼中以持续表达 PEDF,证实能抑制视网膜新生血管[4-8]。给 ROP小鼠眼内注 入 PEDF和病毒载体,与未注射的对照组相比均能 显著减少视网膜血管 的生长,注射病毒载体虽比 PEDF作用小,但病毒载体的确能抑制血管生长,所 以很难评价 PEDF 的独立作用[9]。本实验设立了对照组:ROP模型治疗对照组,小鼠玻璃体内注入 1μlPBS,左右眼突破内界膜的内皮细胞核数没有 差异,从而肯定了 PEDF的独立抑制血管的作用。 
1.PEDF抑制作用与剂量间的关系:生后第12 ~17天是新生血管形成的主要阶段,有实验证实在此阶段PEDF蛋白水平是逐渐下降的,至第16天降 至最低,此时也是新生血管形成最严重的阶段[10]。本实验采用在第12和14天给 ROP小鼠眼内注入不同剂量的 PEDF,结果显示 0.5μg 组 无 抑 制 作 用,1μg和2μg组有抑制作用,说明眼内注射 PEDF 能抑制血管生长,并与剂量有关。
  2.PEDF抑制作用与注药次数间的关系:实验显示在第12和14天二次注入2μgPEDF 可明显 抑制视网膜新生血管形成,因此选择2μg作为注射 剂量,在第12或14天单次注药及第12、14、16天三次注药,结果显示单次注药无效;二次与三次注药均能有效抑制血管生长,但二次组与三次组比较,差异 无统计学意义,说明要选择合适注药次数维持 PEDF的作用,同时又要尽量避免盲目增加注药次 数。
  3.PEDF对正常发育的视网膜血管的影响:非模型治疗对照组小鼠在空气中饲养,第12、14天右眼注入2μgPEDF,结果左右眼的视网膜血管生长 无差异,发育良好,说明 PEDF 不影响正常血管的 生长发育,这与 Stellmach等[11]腹腔注入 PEDF 得出的结果一致,PEDF 不会干扰视网膜血管的正常发育,也有力支持了 PEDF治疗的安全性。 
目前 ROP 的治疗仍以眼科手术为主,但手术往往对眼球造成不可逆损害,术后仍有视力下降及异常血管的复发。PEDF 作为内源性血管抑制因子,能有效抑制血管新生,同时没有发现明显的不良反应,随着对其作用机制的深入研究,进一步证实其安全性和有效性,必将为 ROP 的防治带来新的突 破。



参考文献
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