温故知新​|定量检测孕妇血浆中胎儿 DNA 在 产前诊断的应用

学术   2024-09-12 17:02   北京  

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本文发表于《中华围产医学杂志》2006年第5期
引用格式:吴菁,黄艳仪,陈小蔓,等. 定量检测孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断的应用[J]. 中华围产医学杂志,2006,9(05):297-300. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2006.05.004

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吴菁   黄艳仪   陈小蔓   孔舒
作者单位:510010 广州,广州医学院附属广东省妇儿医院产前诊断中心(吴菁);广州市第二人民医院(黄艳仪、陈小蔓、孔舒) 







【摘 要】


目的    探讨应用荧光定量 PCR技术检测孕妇血浆中胎儿 DNA 量,了解胎儿 DNA 和 母体 DNA 随孕周增长的变化,为将来应用于非创性产前诊断做临床前期研究。 

方法    选择妊娠 7~42周,B超确诊为单胎的孕妇58例,使用 DNA 试剂盒提取孕妇血浆中的胎儿 DNA,用荧光定量 PCR(FQ-PCR)技术测定血浆中β-actin基因和SRY 基因的量。 

结果    58例正常孕妇,有37例男性胎儿,检出率为100%。胎儿 DNA 的量在早孕组为9.08拷贝/ml(3.5~12.8),中孕组为45.41 拷贝/ml(14.38~76.5),晚孕组为300.95拷贝/ml(84~840)。21例女性胎儿均未检出 SRY 基因。 

结论    胎儿 DNA 随着孕周的增加而增长,母体血浆是进行无创性产前诊断的非常有价值的底物。 

关键词】   妊娠;DNA;聚合酶链反应;产前诊断





非创伤性的产前诊断方法是众多学者和医生一直追求和研究的目标。长久以来许多学者致力于研 究利用孕妇外周血中胎儿细胞进行非创伤性产前诊断的方法,虽然取得了一些重要的进展,但是母血中的胎儿细胞数量稀少,富集效率不高且价格昂贵,成为常规应用的主要障碍[1,2]。受到肿瘤患者的血浆和血清中存在癌源性 DNA 的启发,1997 年学者 Lo 等[3]研究发现母体血浆中存在胎儿DNA。接着他又在1998 年用荧光定量 PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术测定孕妇血清和血浆中胎儿 DNA 的浓度[4],为非创伤性产前诊断开辟了一个新途径。本研究应用 FQ-PCR 技术测定孕妇血浆中的胎儿 DNA 的量,不仅可以应用于性连锁遗传疾病孕妇产前性别诊断,而且了解胎儿 DNA 和 母体 DNA 随着孕周的增长是如何发生变化的,为将来进一步扩大临床应用范围做了前期研究。

  资料和方法
  一、资料来源
  1. 早孕组:选取妇产科门诊人流室行无痛人流的初孕妇共20例,孕周7~9周,术前取肘前静脉血 5ml。术后取负压清宫得到的绒毛组织,要求新鲜, 用生理盐水清洗。
  2. 中孕组:选取优生门诊行产前诊断和引产的初孕妇共16例,孕周18~22周,在羊膜腔穿刺术前取肘前静脉血5ml。 
3. 晚孕组:选取产科住院待产初孕的孕妇共22 例,孕周36~42周,在分娩前取肘前静脉血5ml。这些孕妇为正常妊娠,无妊娠并发症和/或妊娠合并症,均经 B 超确诊为单胎,年龄21~30岁,无严重贫血(Hb>90g/L)。
  4. 阴性对照:取正常未孕女性的肘前静脉血 5ml。
  5. 阳性对照:取正常男性的肘前静脉血5ml。 
二、方法
  1. 样本的处理:采集的血液均立即 EDTA 抗凝3000rpm 离心 10 min,小心转移上清液,再次 3000rpm 离心10min,收集上清液血浆,-20℃贮存,待处理。采集的绒毛按绒毛培养染色体常规处理。
  2. 血浆 DNA 的提取:每份标本取2ml血浆用 DNA 提取试剂盒(购于 Qiagen公司)提取 DNA [3], 将提取的 DNA 溶于100μl的 AEbuffer中,然后 读 OD260计算其浓度。
  3.FQ-PCR:应用 FQ-PCR [5,6]的扩增技术,通过 PERKIN-EMER ABI5700检测系统完成,可以同时进行 PCR 扩增以及扩增产物的检测。由于正常母亲和胎儿的 DNA 是非常相似的,要表示胎儿 DNA 的含量所选择的基因必须是胎儿所特有,现在所知道在正常孕妇血液中,胎儿所特有的为 Y 染色体上的基因,故只能选择怀有男胎的孕妇血浆,扩增 Y 染色体上的特异基因用于测定胎儿的 DNA。由此,我们选择性别决定 Y(sex-determining region Y,SRY)基因作为扩增基因计算胎儿DNA 的量,β- actin基因是母体和胎儿共有的基因,因此选取它作为内对照,同时将它作为指标表示提取的母体和胎 儿 DNA 的总量。  
引物和探针的序列如下:SRY 基因:上游引物, 5′-TGGCGATTAAGTCAAATTGC-3′;下游引物,5′- CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT -3′。TagMan 探 针:5′-(FAM)AGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGA(TAMRA)-3′。β-actin基 因:上 游 引 物,5′- TCACCACACTGTGCCCATCTACGA-3′;下游引物, 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′TagMan探针,5′-(FAM)ATGCCC-X(TAMRA)-CCCCCATGCCATCCTGCGT-3′。
  6-羧基荧光素(FAM,荧光发射峰在518nm), 6-羧基四甲基诺丹明 (TAMRA,荧光发射峰在582nm),X代表 TAMRA 的连接处。反应体系的总体积为50μl,包括10μl5×buffer,300nM 的上游和下游引物,100nM 的 TagMan 探针,4 mM MgCl2,200μM,dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 200μM,Tag 酶 3 U。反应条件为:93℃ 2 min, 93℃ 45s,55℃ 60s(10个循环),93℃ 30s,55℃ 45s(30个循环)。每个标本点样3份,每份用10μl 的提取 DNA 加入反应体系中扩增,同时作内对照、 空白对照,并设立阳性标准品,作为定量计算和阳性对照。
4. 统计方法:原始数据用SPSS10.0统计软件处理,各组数据比较用秩和检验法(Kruskal-Wallis ranksum test)分析。 

结 果
  为了检测 FQ-PCR 技术及试剂的敏感性及特异性,本研究用相当于1~1000个细胞的一系列稀 释男性 DNA 作为阳性标准品,分别用于扩增 SRY 基因和β-actin基因,用它们的热循环次数(CT 值) 制成的标准曲线,计算 SRY 基因和β-actin基因的量。图1为PERKIN-EMERABI5700检测系统实 时检测的曲线图,表明随着加入 DNA 量的减少,扩增的曲线向右移动, CT值不断增加。这个反应体系的敏感性可以检测到一个细胞拷贝数。


本实验一共检测了58例正常妊娠的孕妇,结果表明有37例男性胎儿,21例为女性。经绒毛染色体、羊水染色体和新生儿性别证实,结果完全符合。测定男性胎儿母血中 SRY 基因的量早孕组为3.5 ~12.8拷贝/ml,中孕组 14.38~76.5拷贝/ml,晚孕组为84~840拷贝/ml。有30例女性胎儿 SRY 基因的量为零。总 DNA 的量在早孕组为120.41~ 380.25拷贝/ml,中孕组为 634~1284拷贝/ml,晚孕组为1340~32150拷贝/ml。三组的胎儿 DNA、 总 DNA 相比较有明显差异(P<0.01)。见表1。 

讨 论 
一、孕妇血浆中的胎儿 DNA 应用的临床意义 
无创伤性产前诊断是众多学者一直关注的问题,它能在保证母亲和胎儿的最大程度安全的基础 上,准确诊断胎儿的疾病或者给高危产妇一个较可 靠的风险估计。尽管在妊娠期间胎儿的血液循环和母体的血液循环被胎盘膜隔开,但各种证据表明胎盘并不能完全阻碍细胞通行,因而人们一直致力于 研究利用母血作为产前诊断的底物。 
受到癌症病人血浆中存在癌源性 DNA 的 启 发,Lo等于1997年在母体血浆和血清中扩增出特异性 Y 染色体 DNA 序列,后来证实此孕妇怀有男 性胎儿。这项工作首次证实了孕妇血浆中存在胎儿 DNA,并意识到孕妇血浆是胎儿 DNA 和母体 DNA 的混合物,孕妇血浆中胎儿 DNA 的出现可能是由 于物理或免疫因素对母胎界面细胞层的破坏,或是由于胎儿组织的凋亡,导致胎儿 DNA 的释放 [7]。这就提示孕妇血浆中的 DNA 是进行非侵入性产前诊断的一种有价值的底物。 
据有关研究表明,母体血浆中胎儿 DNA 可用 于性连锁遗传疾病早期诊断胎儿性别、RhD 血型不 合溶 血[8,9]、父系遗传 疾病,还可以用于子痫 前期、早产等妊娠相关性疾病[10-13]使无创伤性的产前诊断变为可能。
  二、FQ-PCR技术的优点 
本研究应用 FQ-PCR 技术,又称为实时定量 PCR或 TagManPCR。它是一种新的基因定量检测技术,是在常规 PCR 的基础上加入荧光标记探 针,用光学监测 DNA 的扩增过程,巧妙的把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起,在一个很宽的浓度 范围内给予一个准确的靶定量,敏感性和准确性足 以检测出一个细胞量的 DNA。而且产物的检测在封闭的状态下,避免了扩增产物污染而致的假阳性。扩增、PCR产物的检测和定量分析一体化,在 DNA 扩增过程使污染的危险性降至最低。在本实验中检测了58例不同孕周孕妇血浆样本,胎儿性别诊断完全符合,无假阳性和假阴性的出现。本研究提示,应用荧光定量 PCR技术,可以定量检测母体血浆中胎儿 DNA [14],不仅技术简单,而且敏感性和特异性高,是研究胎儿 DNA 的一项重要技术,在无创伤性产前诊断中将发挥重大的作用。 
三、胎儿基因的选择 
由于正常母亲和胎儿的染色体是基本相同的, 较多见的是怀有男胎时,性染色体的不同。因为在正常女性体内没有 Y 染色体上的基因,如果出现则 是来自胎儿,所以多选择 Y 染色体上的基因用于研究。现在常用的 Y 染色体上的特异基因是 Y 染色体上的睾丸决定因子,它的存在决定未分化的原始 生殖嵴向睾丸分化,而睾丸的分化是性别决定的核心,胚胎具有染色体上的睾丸决定因子则发育为男性,否则发育为女性[15]。它的候选基因有三种:组 织相容 Y(H-Y)抗原的基因、锌指 Y(zinc-fingerY, ZFY)基因、SRY 基因。目前认为 SRY 基因是睾丸 决定因子的最佳候选基因,Sinclair等[16]于1990年将它克隆和精确定位。SRY 基因在进化上具有高度的保守性,位于 Y 染 色体 1A1 亚区,定位在 Yp11.3,长度为 3817bp。SRY 基 因 无 内 含 子 结 构,转录单位全长约1.1kb。其突变、获得、缺失或易位都可导致性反转,出现性别发育的异常。目前国内外多选择 SRY 基因上 DNA 序列作为胎儿特 有基因进行胎儿 DNA 研究。 
四、孕妇血浆中胎儿
  DNA 本研究证实在孕早期就可以检测出母体血浆中胎儿 DNA [17],从而早期鉴别胎儿性别,为性连锁遗传疾病的孕妇提供建议,必要时可早期终止妊娠,减轻对患者的身体损害。这不但是一个简单无创伤性 的技术,而且将为早期诊断某些选择性遗传性疾病开拓一条新途径。本研究证实在母体血浆中可以检 测到较高浓度的胎儿 DNA。而母血中胎儿细胞在孕中期占母体细胞总数 的 0.0035%,在孕晚期占 0.008% [18]。两者相比较,在孕中期和孕晚期母体血浆中胎儿 DNA 的浓度比母血中胎儿细胞高1334 倍和859倍。由于母体血浆中存在较高浓度的胎儿 DNA,可以很容易的检测到,因而将它用于产前诊断是可靠而且易行的。在本研究检测的58例样本中,所有男性胎儿的孕妇血浆中都检测到了SRY 基因,而在所有女性胎儿的孕妇血浆都没有出现阳性曲线。没有出现假阳性和假阴性,证实本研究方法具有较高的特异性和敏感性。
  本研究中选取了初孕妇作为研究对象是为了避免上次妊娠遗留胎儿 DNA 对实验结果产生影响。实际上根据对胎儿 DNA 从母体血浆中的清除率的研究表明[19,20],大部分产妇在产后2h就无法测出 胎儿DNA,半衰期平均约为16.3min(4~30min), 表明胎儿 DNA 可从母体血浆中迅速清除,不会对下次妊娠产生影响,因而也可以用于其他孕妇。
  五、研究前景
  本研究表明母体血浆中的 总 DNA 和 胎儿 DNA 是随着孕周的增加而增长的,其机制可能是由于随着孕周的增加,母儿界面不断增大,因而释放的 DNA 逐渐增加,同时某些生理变化使得对 DNA 的清除逐渐减少。因而产前诊断的时机在妊娠早期、 中期和晚期都可以进行。并且已有研究表明,在病理妊娠和染色体病时,如子痫前期、早产以及唐氏综合征[21,22]时,母体血液中胎儿 DNA 的量增多,因此通过大规模人群研究母体 DNA 与胎儿 DNA 之间的关系,建立正常母体和胎儿 DNA 的浓度平台,将对某些病理妊娠及染色体病的诊断提供帮助。而且母胎间细胞通透的双向性和双模态形式(亦即细胞 DNA 和游离于细胞的 DNA)对于提高对母胎关系的理解提供了许多研究机会。
  目前,母体血浆中胎儿 DNA 尚处于研究阶段, 本研究用 FQ-PCR 的 方法通过检测母体血浆中 SRY [23]基因对胎儿 DNA 做了进一步的研究,但由 于SRY 基因为男性胎儿特有,不能用于女胎,而且不是直接检测胎儿携带的致病基因,有一定的局限性。目前只能应用于不能直接做致病基因诊断的性连锁遗传疾病的产前性别选择。如果可以寻找到一种胎儿特异性的基因,应用于所有的胎儿,大范围的应用于产前诊断,有助于降低先天性疾病患儿的出生率,提高人口素质。 



参考文献

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