温故知新｜新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后caspase-3 蛋白表达与神经元变性的关系

学术 2024-09-14 17:01 北京

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本文发表于《中华围产医学杂志》2007年第3期

引用格式：辛颖,赵永强,孟淑珍. 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后caspase-3蛋白表达与神经元变性的关系[J]. 中华围产医学杂志,2007,10(03)：183-185,插图3-3. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2007.03.010

2、温故知新｜缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织细胞红蛋白的表达

3、温故知新｜阿拓莫兰对新生儿缺氧缺血性脑病的保护作用

辛颖赵永强孟淑珍

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970777)

作者单位:110004 沈阳,中国医科大学附属盛京医院儿科

【摘　要】

目的探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)后半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl asparate-specific proteinase-3,caspase-3)蛋白表达及其与神经元变性的关系。

方法将35只7日龄 Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、HIBD 后 6、12、24、72和120h组,每组5只。HIBD组按 Rice法制成模型。采用免疫组化法及 Fluoro-JadeB (FJB)荧光染色分别观察caspase-3蛋白表达及神经元变性情况。

结果缺氧缺血(hypoxic ischemia,HI)后12h皮质caspase-3表达(0.405±0.021)高于正常对照组(0.367±0.023)(P<0.05),HI 后24h皮质、纹状体及海马caspase-3表达达高峰(P<0.05);至 HI后120h皮质、纹状体和海马 caspase-3表达均与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组大鼠各脑区内FJB阳性细胞罕见,HI后24h各部位脑组织FJB阳性细胞明显增多(P<0.05),72h进一步增多(P<0.05),120h 时 FJB阳性细胞数达高峰(P<0.05)。

结论新生大鼠 HIBD 后脑caspase-3蛋白表达与变性神经元在空间与时间分布上存在一致性,但变性神经元分布得更广泛、更持久。提示caspase-3蛋白可能在缺氧缺血所致神经元变性中起到一定作用。

【关键词】缺氧缺血,脑;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶;神经变性;大鼠

围产期缺氧缺血性脑损伤 (hypoxic ischemic brain damage,HIBD)发病机制复杂,是新生儿死亡和儿童致残的主要原因之一。研究表明半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl asparate-specific proteinase-3,caspase-3)在神经元凋亡过程中起重要作用[1],而新近发现的一种荧光染料———FluoroJadeB(FJB)可特异性地标记变性神经元[2,3]。本研究旨在观察新生大鼠缺氧缺血(hypoxicischemia, HI)后脑组织caspase-3蛋白表达情况,并与 FJB染色法标记的变性神经元相比较,探讨caspase-3蛋白表达在 HIBD所致神经元变性中的作用。

材料和方法

一、动物模型制备与分组

将35只7日龄 Wistar大鼠随机分为正常对照组5只,假手术组5只,HIBD 组25只(又分为缺氧缺血后6、12、24、72、120h5个亚组,每组5只)。正常对照组不做任何处理;假手术组只分离右侧颈总动脉,不结扎;HIBD 组按照 Rice等[4]的方法制备 HIBD动物模型。7日龄 Wistar大鼠用2% 氟烷吸入麻醉,结扎右侧颈总动脉,恢复1h,再将鼠置于含8%O2+92%N2 的环境中2h,温度控制在34℃,湿度(85±5)%。

二、实验方法

1.脑切片制备:于上述各时间点将大鼠用过量戊巴比妥钠麻醉,经左心室升主动脉以生理盐水冲洗净,再用10%中性福尔马林固定灌注,断头取全脑置10%中性福尔马林中固定48h。固定后的脑沿冠状面切成2mm 厚的切片,脱水、透明,石蜡包埋,再制成5μm 厚的切片待用。将同一鼠的相邻脑切片分别用于 FJB染色和caspase-3免疫组化。

2.脑组织caspase-3蛋白表达的检测:采用免疫组织化学法进行检测。脑切片经脱蜡与水化后, 置10 mmol/L 枸橼酸缓冲液中微波炉内加热 10min进行抗原修复。将切片以 1% H2O2 处理 30min,再用含 1% BSA 及山羊血清的 PBS 孵育 1h,以阻断内源性非特异性过氧化反应。一抗用兔抗鼠 caspase-3 抗体 (CellSignalingTechnology), 以1∶500浓度置4℃孵育过夜。二抗采用生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200,室温,1h),采用 Vector ABCElite试剂盒(Pharmingen)DAB法显色,苏木素复染,脱水、透明、封片。结果判定:以胞浆有黄色颗粒沉着为caspase-3阳性细胞。每只大鼠取两张脑组织切片,400倍光镜下观察,取皮质、纹状体和海马各5个视野,经数码相机采样,输入 MetaMorph Imager System Version4.6,计算免疫阳性细胞的平均光密度值。

3.变性神经元的检测:参照 Schmued等[2]描述的方法。脑切片脱蜡,置 100% 乙醇中预处理 10min;再依次放入含1% NaOH 的 80% 乙醇中 5min,70% 乙醇 2 min,双蒸水 2 min,0.06% KMnO4溶液中20min充分氧化以减低背景;再放入双蒸水内2 min,然后用0.1%醋酸溶液配制的 0.001%的 FJB(美国 Chemicon 公司)溶液染色20min(暗室中)。双蒸水洗涤3次,每次1min,将切片置 50℃ 干燥器中 10 min,透明,封片。于 MCID系统荧光显微镜下观察并采集图像。结果判定:暗绿色视野中亮黄绿色细胞为FJB阳性细胞 400倍光镜计数10个视野(皮质4个视野 ,纹状体4个视野,海马2个视野)阳性细胞数,并取其平均值。

三、统计学分析

应用SPSS11.0软件包进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析并采用q检验进行两两比较。

结果

一、新生大鼠缺氧缺血后脑组织caspase-3的表达

正常对照组及假手术组新生大鼠脑组织仅有少量caspase-3阳性细胞,细胞大小、形态正常(图1A、 2A)。脑组织同一部位正常对照组与假手术组的检测结果差异无统计学意义。HIBD 组 HI后6h,缺血侧皮质caspase-3阳性细胞数目增多,着色稍深, 但与对照组差异无统计学意义;HI后12h,阳性细胞数量进一步增加,着色加深,光密度值高于正常对照组和假手术组(P<0.05);HI后24h,阳性细胞数量及着色程度均达到高峰(P<0.05,图1B);此后阳性细胞数量逐渐减少,染色变浅,至 HI 后 120h皮质阳性细胞数量及着色程度与对照组差异无统计学意义(P>0.05,图1C)。缺血侧纹状体及海马于 HI后12h 始caspase-3阳性细胞数目及着色程度增加,24h达表达高峰(图2B,P<0.05),至 HI后120h纹状体caspase-3染色强度减弱,部分阳性染色细胞已高度皱缩,明显缩小,海马caspase-3阳性细胞数量已明显下降,与对照组光密度值差异无统计学意义(P>0.05,图2C)。见表1。

二、新生大鼠 HI后脑组织 FJB染色结果

正常对照组及假手术组新生大鼠脑内FJB 阳性细胞罕见(图3A、4A),HIBD 组 HI后24h脑组织各部位 FJB 阳性细胞均明显增多 (P<0.05), 72h时进一步增多(P<0.05,图3B、4B),120h时阳性细胞数达高峰,染色强度最强 (P<0.05,图 3C、4C)。见表2。

讨论

围产期 HIBD的发病机制迄今尚不十分清楚, 病理过程同时存在细胞坏死与凋亡。Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶,具有特异酶切天冬氨酸氨基位点的特性。其中caspase-3是参与细胞凋亡的 caspase级联反应最终效应子,在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置,被认为是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。本研究显示,新生大鼠 HIBD 后在损伤侧皮质、纹状体、海马均可见caspase-3蛋白表达增强,这些部位是新生鼠对 HI的选择性易感区。皮质、纹状体和海马于 HI后12h发生caspase-3活化,高峰表达均在 HI后24h,活化一直持续至 HI 后120h(本研究的终点),与 Nakajima等[6]的结果略有不同,可能与他们制备模型时新生鼠所处的环境温度较高(36.5℃)、脑损伤较重有关。

由于迟发性死亡的神经元在早期仍显示完整的结构,故不易被发现。分析神经元变性的过程需借助一种简便易行且结果可靠的变性神经元标记物。FJB属于阴离子荧光素衍生物,对变性的神经元具有很高的亲和力,可以选择性地标记变性神经元。FJB染色阳性细胞既包括凋亡神经元,又包括坏死神经元,与 TUNEL 染色有着良好的相关性,但比 TUNEL染色阳性细胞更广泛。与传统的检测神经元变性的镀银法比较类似,但比镀银法更为灵敏、简单和可靠[7]。FJB染色能更精确地显示出不能再恢复功能的神经元。因此,FJB 染色法在用于分析由缺血引起的迟发性神经元死亡方面具有更强的实用性。该方法具有较高的敏感性,在外伤性脑损伤模型中,损伤后3h海马区即可见到FJB阳性神经元, 而损伤高峰需在1d时出现[8]。本研究将 FJB荧光染色用于新生动物 HIBD 的研究,结果显示正常对照组脑内各区罕见 FJB染色阳性细胞,说明该方法有着较好的特异性。FJB染色可清楚地标记出新生动物 HI后的变性神经元,HI后12h脑内即可见 FJB阳性细胞,该细胞数量逐渐增多,染色亦逐渐加深,至120h达高峰,为研究新生动物 HIBD 后神经元变性提供了一种新的方法。

将caspase-3免疫组化与 FJB 染色结果比较发现:caspase-3表达的空间与时间分布与变性神经元的分布存在一致性。例如,皮质与纹状体等至 HI 后5d 变性神经元仍分布较密集的部位,显示 caspase-3活性持续增高;但二者结果也有不同:无论皮质、纹状体还是海马,caspase-3表达高峰均比 FJB阳性细胞数高峰出现早、消失早,如 FJB 染色显示 HI后120h海马变性神经元密度仍高,但此时 caspase-3活性已经减弱。总的来说各时间点 FJB 阳性细胞数要比 caspase-3 阳性细胞数多,且越到HI晚期越明显,提示 HIBD 后神经元变性除 caspase-3激活这一途径外,可能还存在其他途径, 有待进一步研究。

参考文献

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