温故知新​|新生小鼠视网膜病变的基因表达谱变化

学术   2024-09-09 17:02   北京  

点击上方蓝字“中华围产医学杂志” →选择关注| 点击右上角“···” → 选择“设为星标  ”


"温故知新"栏目将定期发送杂志往期刊出文章,便于读者在微信平台回顾经典文章,从而推陈出新,为科研工作提供更多灵感。
本文发表于《中华围产医学杂志》2006年第6期
引用格式:石文静,陈超,胡宝洋,等. 新生小鼠视网膜病变的基因表达谱变化[J]. 中华围产医学杂志,2006,9:(06):385-388,插图6-1. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2006.06.008

相关推荐 

1、推行适合我国国情的早产儿视网膜病变筛查制度

2、温故知新|化学合成小分子干扰 RNA 抑制缺氧大鼠视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α 基因的表达
3、温故知新|早产儿视网膜病基因多态性研究进展

石文静   陈超   胡宝洋   龚红华   周国民
作者单位:上海 200032,复旦大学儿科医院新生儿科(石文静、 陈超);复旦大学上海医学院人体解剖与组织胚胎学系(胡宝洋、龚红华、周国民)
通信作者:陈超







【摘 要】


目的   应用基因芯片技术研究早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)基因表达谱的变化规律及意义。 

方法   7日龄 C57BL/6J新生小鼠暴露于75%的高氧5d后回到空气 中,制成 ROP动物模型,应用 Trizol法抽提17日龄小鼠 ROP模型及同时期对照组小鼠的视网膜总 RNA,逆转录并用 Cy3和 Cy5标记,与小鼠 Oligo表达谱芯片杂交,扫描后获取基因表达信息,进行差异分析、聚类分析和基因分类等生物信息学分析。 

结果   与正常小鼠比较,视网膜病变小鼠有 1347个基因呈差异表达。SOM 聚类显示12类不同的表达差异变化模式,基因本体学分析显示变化的基因并不局限于血管生成相关因子,发育相关基因及 G蛋白信号通路相关基因改变亦很明显(P< 0.05)。 

结论   ROP小鼠视网膜基因表达谱有较大改变,为今后从分子生物学角度探索该病发病机制和进行基因治疗奠定基础。

【关键词】   寡核苷酸序列分析;视网膜病,早产儿;基因表达谱;小鼠 





早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity, ROP)是发生在早产和低出生体重儿的一种纤维血管增殖性视网膜病,严重时可导致失明,其发病率近年在发展中国家呈逐年上升趋势。目前的研究显示该病的发病机制主要是新生血管形成[1-5]。但是,大量动物研究应用各种方法抑制新生血管形成,并不能完全预防和治疗 ROP 的发生,究竟有多少细胞因子参与新生血管形成,目前尚不清楚;而且,对于是否有其他机制参与 ROP发病的研究更少。临床上观察到并非所有的早产低出生体重儿都发生 ROP,有些早产儿即使不吸氧或出生后临床经过较稳定者也会发生各种程度的 ROP,有些早产儿虽然应用呼吸机长达数月却不发生 ROP 改变,因此, ROP患者是否发生了某些基因的改变? 基因芯片技术可对上千种基因的表达水平、突变和多态性进行快速、敏感、高效的检测,目前已广泛应用于高通量基因表达平行分析、大规模基因发现及基因分析、基因诊断、基因多态性分析等,特别在表达谱中有重大应用价值[6,7]。本研究旨在应用基因芯片技术对 ROP小鼠基因表达谱的变化进行系统研究,为今后从分子生物学角度探索该病发病机制和进行基因治疗奠定实验基础。 

材料和方法
  一、实验动物 
1. 动物及分组:选取32只7日龄C57BL/6J新生小鼠,随机分为 ROP 组(n=16)和对照组(n= 16),ROP组在7日龄吸75%氧5d,然后回到空气 中,制备 ROP动物模型[8,9],对照组在室内空气中, 生后第17天两组取材。 
2. 取材:快速颈椎脱臼处死小鼠,无菌条件下在体视显微镜下迅速分离视网膜,立即置于 1 ml Trizol中,匀浆后液氮保存。每组视网膜作为一个混合样品。 
二、方法 
应用基因芯片技术研究 ROP小鼠基因表达谱的变化,基因芯片技术由上海生物芯片有限公司提供。具体步骤包括总 RNA 的抽提、琼脂糖凝胶电 泳和 Lab-on-chip 鉴定 RNA 质量、mRNA 分离、 cDNA 荧光探针的制备、纯化和定量、芯片的杂交、 洗片、图像获取、数据读取和处理,得到ratio值。
三、统计学方法 
以P<0.05为界值选取差异表达的基因,并在此基础上选取ratio值相差2倍以上的基因为上调 或下调基因(ratio分析)。用 genespring分析软件 进行聚类分析,并进行基因功能分类分析。 

结 果 
一、总 RNA 抽提及质量检测 
抽提所得总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳和 Labon-chip证实能应用于芯片的杂交(图1)。
  二、基因芯片杂交效果
  芯片信号强度适中,杂交点分隔清楚,背景清晰; 经散点图分析,两张芯片之间重复性良好(图2)。 
三、阳性表达的基因和有差异表达的基因 
经过数据过滤处理后,本实验样本中表达的基因数为11519个,约占芯片中基因总数的 2/3。经统计分析,有差异表达(P<0.05)的基因数为1347 个,改变水平在2倍以上的上调基因有646个,下调基因有378个,上调基因数量约为下调基因的2倍 (图3)。 
四、基因聚类分析结果 
聚类分析(self-organizing map,SOM)将差异表达的基因聚分为12(4×3)类,前面7类基因呈上调趋势,上调的程度和数量从第1类至第7类有一 个先上升后下降的变化过程;第8类基因的变化不大;从第9类起基因呈下调趋势,下调的程度和数量呈递增现象。 
五、差异表达基因的功能分析 
采用基因本体学(gene ontology,GO)分析软 件,GO miner主窗口中显示主要信息,包括 GO 分类目录、每类基因中的总基因数、下调基因(绿色)、 上调基因(红色)及总差异表达基因(蓝色)的相对丰度及 Fishert检验的P 值。
 与对照组比较,ROP组生物学过程类基因中下调基因增多(相对丰度1.08,P=0.01),其中生理过程亚类有较多的下调基因 (相对丰度 1.09,P= 0.04);细胞成分类基因中上调基因增多(相对丰度 1.08,P=0.01),其中细胞外成分较多,但差异无统计学意义(相对丰度1.19,P=0.10);分子功能类基因中 显示有较多的下调基因 (相对丰度 1.03, P=0.14),其中结合蛋白 (相对丰度 1.13,P = 0.03)和催化活性蛋白(相对丰度1.15,P=0.08)这两个亚类基因下调较多,而信号转导活性亚类则有较多上调基因(相对丰度1.27,P=0.07)。 
在发育过程中,器官发生相关基因 的 BMP7, HOX 家族有 HOXA9、HOXA10 和 HOXC8 以及 Wnt4下调,而 HOXA4上调;与肾上腺发育相关的 上调基因(相对丰度27.50,P=0.04)有 PBX1;血管发育相关基因中仅 FGF2 和 POFUT1上调,而 FLT1下调;眼发育相关基因中 CYRGC下调;肌肉发生相关的上调基因(相对丰度2.97,P=0.04)占多数;与周围神经发育相关的感觉器相关基因普遍下调(相对丰度9.25,P=0.00)。 
G 蛋白偶联受体蛋白信号通路中相关蛋白的基因上调较多(相对丰度1.64,P=0.01),与环核苷酸第二信使偶联蛋白的基因上调较多,与IP3偶联的蛋白基因则没有上调(相对丰度0.00,P=1.00)。神经胶质细胞分化相关基因中,正性调节基因 FGF2(相对丰度5.59,P=0.17)和负性调节基因 FOXG1(相对丰度27.96,P=0.04)均有上调。与信号转导功能相关的基因表达有上调也有下调,以上调基因的数量居多,尤其是受体活性相关基因(相对丰度1.58,P=0.01),而核受体、神经递质受体和 γ-氨基丁酸受体活性的基因则以下调占多数。转运体家族的基因表达改变较复杂。在细胞防御反应相关基因中,Th1介导的细胞免疫相关基因IL-18下调,而正性调节IL-12合成的IRF1、RELA 基因则呈上调趋势。表1所列为与对照组相比较,ROP组小鼠视网膜上部分呈差异表达的基因及其功能分类。 

讨 论 
ROP的发病机制目前认为主要是新生血管形成。由于生后第17天是 ROP小鼠视网膜新生血管大量形成的重要时期[8],因此本研究选择该时间点制作基因芯片,希望在形态学上有显著改变时能发 现一些重要的基因变化,如与血管生成相关的一些细胞因子如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因 子2、胰岛素样生长因子1和雌激素受体等,上述细胞因子在前期工作中已通过 RT-PCR 方法证实了它们在 ROP 的发生和发展中起重要作用[9],可能对预防和治疗 ROP 有一定价值;大量的其他促进或抑制血管生长的细胞因子,或是与血管生长无关的其他基因,也许在 ROP发病中也发挥作用,但目前尚未被重视或认识。 
基因芯片技术非常适用于基因表达谱研究[10-17]。因为表达序列仅占整组基因的3%,以杂 交为基础的表达谱分析将有效降低基因组研究的复杂性。本研究采用的生物芯片是上海国家研究中心以 Qigen Mouse1.0为基础开发的SBC Mouse1.0 寡核酸芯片,与 cDNA 芯片相比具有高容量的特点。 
Ratio分析显示,有差异表达的基因在1000个以上,与采用 Affimetrix Oligo芯片的研究结果基本一致[18]。在选取有差异表达的基因时,本研究首 先根据重复实验所得的统计检验结果,结合倍数选择,使结果更具有意义。 
根据 SOM 分析将基因进行分类后,分类图上可以看到除极少数基因变化不大外,其余均有较大变化,前3类上升最明显,后2类下降最明显。由 Genespring软件自带的基因简单分类显示,差异改变的已知基因中,主要是细胞功能蛋白及生物过程相关蛋白的改变,细胞成分改变较少。细胞生物过 程相关蛋白中,SLC 转运体家族上调程度较明显, 而 Fxyd2(FXYDdomain-containing ion transport regulator2)则下调明显。信号通路成分中,Nelf (nasal embryonic LHRH factor)上升明显,Strap (serine/threonine kinase receptor associated protein)则明显下调。细胞成分中主要是细胞内成分的改变。分子功能蛋白中,主要是酶类和核酸结合蛋白的改变。与用 GO 数据库得出的结果基本一致。 
GO 通过建立一套具有动态形式的控制词汇表,来解释真核基因及蛋白在细胞内所扮演的角色。它已经成为生物信息领域中一个极为重要的方法和工具。可以说,GO 是生物学的统一化工具。到目前为止,基因本体学协作组的数据库中有3大独立的ontology被建立起来:生物过程、分子功能及cellular component细胞组分。3 类主ontology 是独立的,而这三个ontology下面又可以独立出不同的亚层,层层向下构成一个 ontologies 的树型分支结 构。GO 分类的方式使研究人员除了按基因表达的特点及模式来分析基因表达谱外,还可以根据每基因在生物功能或生物过程中与其他基因变化的关系,发现新的信息线索。GO数据库网址为 http: //www.geneontology.org/GO.doc.html。
通过 GO miner利用 GO 数据库,将本地芯片中表达基因与差异表达的基因与数据库中的基因作比较,以表达相对丰度的概念来显示每一类基因相对于整个芯片上基因平均改变水平的强度,同时作出出现这种差异的统计学分析,用于表达改变水平判断的参考。同时,该系统还将基因差异表达的信息通过 DAG 图形的方式表现出来。用 Genespring分析出小鼠出生第17天的差异表达基因后,将基因表 达信息在 GO 数据库内作比较分析后,获得各种分 类中基因差异表达程度的参数。结果提示,差异表达的基因较为分散,血管生成相关基因的表达在整个改变中仅占很小的比例,这可能与本研究选取的时间点有关,因为在这个时间点上,新生血管已经大量生成[8],尽管血管生长因子的表达有上述不同程度的表现,但已不如出生第12到第17天这一时间段明显,也提示视网膜发育和 ROP 发育过程中需要血管生成调节因子的良好调节作用,在不同时期, 有不同的调节因子起主导作用,而到第17天时,这些因子与对照组间的表达差异已明显减少。G 蛋白偶联受体蛋白相关基因普遍上调,上调的基因主要是与环核苷酸第二信使偶联;与神经、胶质发育相关的基因也有较明显的改变。 
基因表达谱分析目的主要是发现 ROP较为全面的基因谱的改变,有待在细胞和分子水平进一步验证,才能更深入了解 ROP 的发病机制和探索新 的治疗方案。因此,本芯片所包含的大量信息,有待在今后的实验中得到进一步分析和验证。 



参考文献 
▲上下滑动查看更多

未经授权禁止转载,一经发现立即举报。

本平台学术内容仅供医学专业人员参考。除非特别声明,发送的所有内容不代表中华医学会和本刊编委会的观点。译文或摘译类文章,详细内容请参照原文全文。



点击阅读原文获取更多内容!

中华围产医学杂志
中华医学会系列杂志、中国科技核心期刊、中文核心期刊《中华围产医学杂志》官方微信平台
 最新文章