温故知新​|​60%氧暴露对早产大鼠肺血管内皮生长因子及其受体表达的影响

学术   2024-09-14 17:01   北京  

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本文发表于《中华围产医学杂志》2007年第3期
引用格式:王伟,韦伟,王安茹,等. 6O%氧暴露对早产大鼠肺血管内皮生长因子及其受体表达的影响[J]. 中华围产医学杂志,2007,10(03):186-189,I0001.

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王伟  韦伟  王安茹  蒙晶  宁琴  罗小平
基金项目:国家杰出青年科学基金(30125019);国家重点基础研究发展计划(973计划)(2005CB522507)
作者单位:430030 武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科学系
通信作者:罗小平 







【摘 要】


目的   观察60%氧暴露对早产大鼠肺血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体———胎肝激酶-1受体(fetal liver kinase-1,Flk-1)表达的影响,探讨其与新型支气管肺发育不良发病机制之间的关系。 

方法   早产鼠生后6h内随机分为中浓度氧组(简称中 氧组)和空气组,空气组置于常压空气中,中氧组置于氧体积分数为60%的氧舱中,两组动物均于生 后1、4、7、11和14d各随机取8只,行 HE染色,观察肺组织形态学结构,做辐射状肺泡计数(radial alveolarcounts,RAC);采用 Western印迹和 RT-PCR技术检测各组肺组织 VEGF及其受体 Flk-1蛋 白及 mRNA 表达水平。 

结果  (1)中氧组 RAC 在7d时为8.32±0.11,11d时为8.53±0.08, 14d时为9.03±0.17,明显高于空气组相应时间点的 RAC 值;(2)中氧组 VEGF 及 其 受 体 Flk-1 mRNA表达水平在第7、11和14天均低于空气组相应时间点,差异有统计学意义 (P<0.05);(3)中氧组 VEGF蛋白表达水平在第11、14天时低于空气组;受体 Flk-1蛋白表达水平与其 mRNA 表达变 化规律基本一致。 

结论   60%氧暴露可引起早产大鼠肺部 VEGF及其受体 Flk-1表达下降,可能 是引起肺微血管发育障碍及肺泡化进程受阻,进而导致新型 BPD发生的重要因素。 

【关键词】   高氧 症;支气管肺发育不良;血管内皮生长因子 A;血管 内皮生长因子受体 2; 大鼠;婴儿,早产 





新型支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿的一种常见慢性肺疾病。多项研究表明高氧暴露与新型 BPD的发生密切相关,但 目前研究多集中在高浓度氧(体积分数≥90%,以下均指体积分数)暴露引起的急性肺损伤。而临床上对早产儿/新生儿多选用中浓度氧疗,关于中浓度氧暴露与新型BPD发病机制之间关系的研究报道甚少。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelia lgrowth factor,VEGF)是肺血管发育的关键因子,是目前已知最有效的血管生成素蛋白。本研究拟对早产大鼠进行60%氧暴露,观察中浓度氧暴露对 VEGF及其受体———胎肝激酶-1受体(fetal liver kinase-1,Flk-1) 表达的影响,探讨中浓度氧暴露对肺血管发育信号传 导通路的影响及其与新型BPD发生发展的关系。 

材料和方法
  一、实验动物与试剂
  健康SpragueDawley(SD)大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。总 RNA 提取试 剂(商品名:Trizol)购于美国 Gibco公司。小鼠抗 VEGF164、Flk-1和β-actin单克隆抗体均购于美国 SantaCruz 公司。随 机 引物 OligodT12-18、MMLV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂 (RNasin)及 Taq DNA 聚合酶购于美国 Promega 公司。VEGF、 Flk-1及β-actin引物由上海英骏公司合成。 
二、实验方法
  1.动物模型的制备及分组:清洁级 SD 雌雄大鼠按3∶1夜间合笼交配,次日晨取雌鼠阴道分泌物涂片,镜检见精子,当日记为妊娠第1天,早产大鼠 于孕21d(预产期为22d)剖宫娩出,由当日分娩的其他母鼠作其代母鼠。早产鼠于生后6h内随机分为空气组和中浓度氧组(简称中氧组),空气组置于常压空气中,中氧组置于体积分数为 60% 的氧舱中,每天开箱约1h用于添加饲料及更换垫料,并与空气组互换母鼠以避免母鼠氧中毒影响哺乳。当某一组新生鼠发生死亡后,同时将另一组去掉相同数目的新生鼠,以保持各组新生鼠数目相同,防止因营养因素引起的差异。早产鼠分别于中氧/空气暴露 1、4、7、11和14d后,每组随机取8只,以20%乌拉坦0.5ml腹腔麻醉,气管插管保持肺充气状态,开胸放血,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗肺直至白色,结扎左支气管,迅速切取左肺,液氮速冻后存于-80℃冰 箱,用于肺组织 VEGF及 Flk-1mRNA 的检测。右支气管注入 4% 多聚甲醛至肺尖膨胀,取右肺,置 4%多聚甲醛固定液中4℃固定12h,常规石蜡包埋切片,用于观察肺组织发育情况及病理改变。
  2.肺组织形态学、辐射状肺泡计数 (radial alveolar counts,RAC)检测:取肺石蜡块,5μm 切片,HE染色,光镜下观察肺组织发育情况及病理改变。参照Jakkula等[1]的方法,计数从呼吸性细支气管中心至最近纤维隔或胸膜直线上的肺胞数即 RAC值,反映终末呼吸单位含肺泡数的多少,衡量肺泡化程度。每张切片计数10次,取平均值。 
3.肺组织 VEGF及 Flk-1mRNA 的检测:采用 RT-PCR技术,用 Trizol试剂提取总 RNA,逆转录为 cDNA,以此为模板行PCR扩增。PCR引物序列及扩 增产物片段见表1。VEGF引物序列适合大鼠所有3 种异构体。PCR反应条件:94℃预变性5min,加入 TaqDNA聚合酶,94℃变性45s,72℃延伸1min,不 同温度退火45s:VEGF 为54.9℃,Flk-1 为55.4℃。反应32个循环,最后72℃延伸7min。然后用1.5% 琼脂糖凝胶电泳30min。MUVB220 凝胶分析系统 (Ultralum 公司,美国)对扩增产物条带进行分析,分别测定各扩增带吸光度(A 值),将目的基因 VEGF和 Flk-1扩增带A 值与内参照β-actin扩增带的A 值之比作为其 mRNA的相对水平。

4.肺组织 VEGF及 Flk-1蛋白含量的检测:采用 Western印迹方法,每50mg肺组织加400μl裂解液提取总蛋白。取40μg总蛋白进行SDS-PAGE 电泳,转膜,37℃摇床封闭1.5h后,加入1∶400稀 释的 VEGF164或 Flk-1及内参β-actin单克隆抗体,4℃孵育过夜,洗膜4次,每次10min,然后加入 经1∶2000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗, 37℃孵育1h,洗膜3次,每次15min,DAB显色,对结果进行吸光度扫描,将结果与内参照 β-actin的 A 值之比作为其蛋白水平的相对含量。
三、统计学方法
  应用SPSS12.0统计软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较采用单因素方差分析,采用q检验进行两组间差异性分析。P<0.05判定为差异有统计学意义。 

结 果
  一、肺组织病理学改变 
空气组生后1~14d随鼠龄增加,RAC 增多, 肺组织发育逐渐成熟,肺泡结构逐渐规整,大小较均匀,肺泡间隔逐渐变薄。中氧组在生后1d和4d肺 泡结构和 RAC 与空气组比较差异无统计学意义 (P>0.05),但自第7天开始肺泡壁开始变薄,部分肺泡融合,RAC低于空气组,至11d和14d出现肺泡大小不均,间隔较薄,肺泡结构简单化,部分肺间质纤维化,RAC均明显低于空气组,差异有统计学意义(P<0.05)(表2,图1~4)。 


二、VEGF、Flk-1mRNA 表达强度
  1.VEGFmRNA 的表达:空气组肺组织 VEGF mRNA 表达自生后随鼠龄逐渐升高,至11d达高 峰,14d持续高表达;中氧组 VEGF mRNA 的表达在第7、11和14天比空气组下降,差异有统计学意 义 (P<0.05)(图5)。
 2.Flk-1 mRNA 的表达:空气组肺组织 Flk-1 mRNA 的表达水平在第7、11和14天与同组上一 时间点相比差异有统计学意义 (P<0.05);中氧组 Flk-1mRNA 的表达在第7,11和14天比空气组下降,差异有统计学意义 (P<0.05)(图5)。

2.Flk-1 mRNA 的表达:空气组肺组织 Flk-1 mRNA 的表达水平在第7、11和14天与同组上一时间点相比差异有统计学意义 (P<0.05);中氧组 Flk-1 mRNA 的表达在第7,11和14天比空气组下降,差异有统计学意义 (P<0.05)(图5)。
  三、VEGF及 Flk-1蛋白含量的变化 
1.VEGF164 的表达:中氧组 VEGF164 表达水平在第11和14天明显低于空气组,差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。 
2.Flk-1的表达:两组 Flk-1蛋白表达强度变化与其 mRNA 表达变化基本一致(图5)。

讨 论 
1967年 Northway等[2]首次提出 BPD 的概念, 指出 BPD是继发于严重呼吸窘迫综合征的一种慢性肺病,患儿需要持续的高浓度氧治疗和机械通气, 并且在生后28d后仍需要氧疗。近年来随着新生儿重症监护水平的提高、肺泡表面活性物质的应用和辅助通气技术的改善,部分患儿在出生时可缺乏 严重呼吸窘迫综合征症状或症状较轻,但出生后一 周内其对氧和辅助通气的需求逐渐增加,此类 BPD 被称为“新型 BPD”[3]。有关新型 BPD 发病机制的 研究目前多集中在高浓度氧疗(体积分数90%)引 起的急性肺损伤方面,而中浓度氧疗更接近临床实际,但关于中浓度氧暴露对肺尤其是早产肺发育的影响目前报道甚少。由于早产肺发育正处于肺泡形成的关键时期,氧疗更易对其正处于增殖发育活跃期的肺部细胞产生抑制和损害作用。观察中浓度氧 (60%O2)暴露对早产鼠肺发育的影响将有助于BPD发病机制和临床防治的进一步研究。 
本研究结果显示:空气组早产大鼠生后1~14d 随鼠龄增加,肺组织发育逐渐成熟,肺泡结构逐渐规整,大小较均匀,肺泡间隔逐渐变薄;60%中浓度氧 暴露早期(1d和4d)肺泡结构与空气组相比无明显差异;但自第7天肺泡壁逐渐变薄,部分肺泡开始 融合,至第14天肺泡结构简单化、大小不均、壁较 薄、大量肺泡出现融合、RAC减少、部分肺间质纤维化等,类似新型 BPD的病理改变。Han等[4]在对新生大鼠进行60%氧暴露14d后也发现肺组织结构出现类似 BPD的病理改变。
正常肺发育是一个复杂的、严格遵循时空规律的过程,受多种生长因子的精确调控。其中 VEGF 为传递内皮细胞有丝分裂信号,促进内皮细胞增殖、 分化,诱导肺血管发生的重要因子。VEGF在鼠类根据 mRNA 的剪接不同产生三种不同活性和作用的异构体,其中 VEGF164在肺发育过程中起重要作用[5]。VEGF发挥生物学效应主要是通过其膜受体 Flk-1介导实现的。本研究结果显示:60%中浓度氧暴露7d后可引起 VEGF mRNA 表达明显降低。VEGF164蛋白的表达在60%O2 暴露第11天和14天显著低于空气组。国外学者研究发现高浓度氧(>95%)暴露可导致新生大鼠(兔)肺组织 VEGF及其受体 mRNA 和蛋白表达降低[6,7]。本研究结果与其基本一致,但 VEGFmRNA 和 VEGF164蛋白下降的时间点稍推迟,可能是因为高浓度氧暴露对肺发育的影响表现为急性肺损伤,而中浓度氧暴露引起的主要为慢性肺损伤。60%氧暴露后引起肺组织 VEGF 及其受体 Flk-1表达下调的机制可能 是:VEGF作为一种旁分泌介质,主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞等分泌,Flk-1 也主要由支气管上皮细胞和微血管内皮细胞分泌,而高氧暴露可引起肺组织细胞,特别是肺上皮细胞凋亡增加, 肺组织细胞数目减 少,从而导致 VEGF 及其受体 Flk-1分泌减少。既往研究证实新生大鼠高氧暴露 (60%或95%)后可暂时上调肺组织 p53和 Bax基因的表达,阻止 G0/G1 期细胞进入 S期,抑制细胞 裂、增殖,从而导致肺部细胞凋亡增加[8,9]。 
在胚胎及生后肺发育过程中,VEGF及其受体都发挥着重要作用。VEGF及其受体表达下调,可能会导致肺微血管发育障碍[10]。Maniscalco等[11] 在对早产狒狒100%氧暴露或机械通气14d后也观察到 VEGF及其受体表达下调,可引起肺毛细血管扩散受阻,在肺中不能形成广泛的网络,这种现象在对因 BPD死亡患儿的病理检查中也进一步得到证实[12]。新近研究发现 VEGF及其受体不仅作用于血管内皮细胞,还可通过自分泌途径作用于肺上皮细胞,促进其增殖、分化和肺泡表面活性物质的生成[13]。VEGF及其受体表达的下调,除引起肺微血管发育受阻,还可进一步导致肺泡化过程 受阻。Compernolle等[14]在对新生鼠应用 Flk-1特异性拮抗剂Su-5416后发现肺部微血管发育障碍,血管密度降低,同时肺泡数目 大大减少。以上研究表明 VEGF信号传导通路介导的肺部血管生成是肺发育的关键。VEGF及其受体 Flk-1表达下调,可影响肺微血管发育,进而阻碍肺泡化进程。 
综上所述,长时间60%氧暴露可下调早产大鼠肺组织 VEGF及其受体的表达,引起肺微血管发育障碍,肺泡化过程受阻,可能是导致新型 BPD 发生 的重要因素。鉴于此,临床医生在对早产儿进行长时间中浓度氧疗时应权衡利弊。




参考文献
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