干细胞的分离与应用是一个跨学科的生物技术领域，它不仅在医学领域用于组织修复、疾病治疗和药物筛选，还扩展到农业和食品工业中，如通过细胞培养技术生产细胞培养肉，减少对传统畜牧业的依赖，同时在合成生物学中利用干细胞作为生物元件，构建复杂的生物系统，推动生物制造和生物能源的发展。
本系列将以人脐带间充质干细胞，动物胚胎干细胞，动物成体干细胞为例全面阐述影响干细胞干细胞分离成功的因素以及必要的工艺条件。
人脐带间充质干细胞的分离与培养
一、应用背景
人脐带间充质干细胞（MSCs）在医学领域具有广泛的应用潜力，尤其在细胞治疗、外泌体研究和其他相关领域中发挥着重要作用。
在细胞治疗方面，MSCs因其多向分化能力，能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，被广泛应用于骨折不愈合、软骨损伤、皮肤缺损等疾病的治疗中。此外，MSCs的免疫调节功能使其在治疗自身免疫性疾病如多发性硬化症、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮等方面显示出巨大潜力。在心血管疾病治疗中，MSCs通过分泌生长因子和细胞因子促进血管生成和心肌细胞再生，改善心脏功能，已在心肌梗死和心力衰竭等心血管疾病的治疗中显示出积极效果。神经系统疾病治疗也是MSCs的重要应用领域，它们能够穿过血脑屏障，对神经损伤和退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病和脊髓损伤等进行治疗，通过分泌神经营养因子促进神经细胞的生存和再生。
在组织工程领域，MSCs结合生物材料如胶原支架，用于修复和重建受损的组织，如子宫内膜、软骨和皮肤等，提高了治疗效果和细胞的存活率。
外泌体作为MSCs分泌的细胞外囊泡，携带蛋白质、RNA、DNA等生物活性分子，参与细胞间通讯，在免疫调节、促进组织修复、抗炎和抗肿瘤等方面显示出巨大潜力，可作为药物递送系统，用于治疗肿瘤和其他疾病。外泌体在体液中的存在也使其成为疾病诊断的潜在生物标志物，能够反映细胞状态的改变，并用于监测疾病进展和治疗反应。
二、实验材料准备
试剂：人间充质干细胞完全培养基（ α-MEM基础培养基+10% FBS+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+1% ITS+20 ng/ml EGF+20 ng/ml β-FGF+1%P/S）（或市售人间充质干细胞无血清培养基）、D-hanks液、三抗。
耗材：50-100mL无菌采样瓶、50ml离心管、10ml移液管、1000ul枪头、 200ul枪头、T25培养瓶、眼科手术剪、镊子等。
仪器设备：离心机、超净工作台、细胞计数仪、电子移液器、手动移液器、电子显微镜
三、样本采集
采集8小时内的脐带一条，长度≥5cm，保存于含5%~10%双抗的完全培养基中，放入无菌采样瓶中4℃保存。
四、脐带预处理
将无菌采样瓶放入洁净区的无菌操作台中，打开脐带采集瓶，倒掉多余液体。 用D-hanks液洗涤脐带采集瓶中的脐带两遍。 用镊子取出脐带，用D-hanks液洗净脐带外周血渍。 剪掉绑有脐带绑绳的两端，中间段脐带使用有齿镊和止血钳去除脐静脉和脐动脉内的残留血液，再次清洗一次，并将脐带剪成3cm左右长的小段。 去除脐带的1条脐静脉和2条脐动脉，分离出华通氏胶。 注：一定要将1条脐静脉和2条脐动脉剔除干净，撕出的华通氏胶尽量不要带有静动脉和羊膜组织，否则容易引入杂细胞，影响UCMSC的后续纯度。静动脉内部和脐带表面残留的血液需要洗干净，同样目的是避免混入过多红细胞在初期吸收过多培养基中营养物质，影响后续UCMSC的生长和增殖。 用弯剪将离心管中华通氏胶剪成2-3mm2大小。 将华通氏胶转移至50mL离心管中。 在组织块中加入5mL 人脐带间充质干细胞完全培养基，混匀。 将其转移到T25培养瓶中，并将组织块均匀铺在T25培养瓶内。 将培养瓶放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
五、换液操作
完成脐带原代处理后第5天，进行第一次换液。
尽量在不影响组织块贴壁的情况下，回收培养瓶内的培养液和未贴壁的组织块。
回收组织块和旧的培养基经过250×g，6min离心后，倒掉上清液。
重新加入脐带间充质干细胞完全培养基，重新接种于T25培养瓶。
注意：全程都要动作轻柔，尽量不影响贴壁组织块的贴壁。
完成第一次换液后第7天，细胞第二次半换液(可以根据生长情况适当调整)。
尽量在不影响组织块贴壁的情况下，用10mL移液管回收培养瓶内的半量培养液。
重新加入5mL人脐带间充质干细胞完全培养基于T25培养瓶中。
完成第二次换液后每隔3天进行半换液一次，直到细胞可以进行传代。
六、初次传代
确认可以进行细胞传代后，去除漂浮和大块的组织块。合并回收培养瓶内的组织块和细胞培养液。 经300×g，离心5min，收集上清液。 培养瓶内的细胞使用D-Hanks液涮洗残留的培养基后，T25培养瓶加入1mL 胰蛋白酶，消化贴壁细胞。 消化完成后按T25培养瓶加入之前收集的上清液5mL终止消化，剩余组织块混合液留离心管中，标记，存4℃冰箱备份，直至细胞完成冻存。 回收所有细胞悬液加入PBS至15mL后经100μm细胞滤网过滤收集滤液，250×g，6min离心后弃去上清。 细胞沉淀用10mL PBS重悬，取样300ul左右细胞悬液，计数细胞数量和活率。 根据接种密度要求，吸取需要的细胞悬液，250×g，6min离心后弃去上清，加入5mL 人脐带间充质干细胞完全培养基接种于1个T75培养瓶内。 将培养瓶放入培养箱中37℃，5%CO2条件培养。
七、后续传代
将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。5.2 吸去培养容器中的培养基。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤细胞2次，注意动作轻柔，清洗全面，吸去PBS。 加入胰酶(T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL)，迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。立即加入完全培养基(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)，随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。 使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。 注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。 将细胞悬液转移至离心管中。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤容器1次，收集残留细胞。 收集的所有细胞悬液以250×g，离心4min。 离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。将细胞按(2.5~4)×104个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。
注意:培养人脐带间充质干细胞对于细胞密度有较高的要求，我们建议有条件且计数效率较高的情况下，进行手工计数，以期获得精准的细胞浓度指导接种；在没有精确计数条件的情况下，按照适宜比例传代是更好的方法。通常人脐带间充质干细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。 传代次日，观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞，应予以换液。待细胞生长至90%汇合，即需传代或冻存。 注意：正常情况下人脐带间充质干细胞每代生长时间不超过72h，中途不需要换液。频繁换液会破坏构建起的细胞微环境。
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