2024年，浙江大学动物科学学院的Min Zhou和TiZhong Shan中在《Food Hydrocolloids》杂志发表了题为“Production of sodium alginate-gelatin composite hydrogel-based 3D cultured fat with low cholesterol and high polyunsaturated fatty acids”的论文。
本文主要研究了利用海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架生产低胆固醇、高多不饱和脂肪酸的3D培养脂肪。研究发现，磷脂酰胆碱（PC）可以促进纤维脂肪前体细胞（FAPs）的脂肪生成分化，加速脂质积累，并促进3D培养系统中脂肪的生成。特别是当PC被装载到小球藻（Euglena）中进行共培养时，脂肪中的甘油三酯（TGs）含量进一步增加。多组学分析揭示了PC处理显著改变了由FAPs产生的培养脂肪的脂质组成，并增加了TGs，特别是多不饱和脂肪酸（如α-亚麻酸和亚油酸）的含量。更重要的是，PC处理还降低了培养脂肪的总胆固醇含量。这项研究为生产“高多不饱和脂肪酸和低胆固醇”的培养脂肪提供了创新方法。
01：摘要
培养脂肪是细胞培养肉的重要组成部分，提供人体必需脂肪酸和磷脂，同时富含胆固醇。然而，关于调节细胞培养肉的营养成分的研究很少，特别是关于多不饱和脂肪酸(PUFAs)和胆固醇的沉积。本研究利用海藻酸钠-明胶支架生成培养脂肪，发现在海藻酸钠-明胶三维培养体系中，磷脂酰胆碱(PC)能促进纤维-脂肪祖细胞(FAPs)的成脂分化，加速脂质积累，促进培养脂肪的生成。有趣的是，当将PC加载到Euglena (Eg-PC)中共培养时，脂肪中甘油三酯(TGs)含量进一步增加。多组学分析显示，PC处理显著改变了FAPs产生的培养脂肪的脂质组成，增加了TGs的含量，特别是PUFAs (α -亚麻酸和亚麻酸)的含量。更重要的是，PC处理还降低了培养脂肪的总胆固醇含量。这项研究为生产“高PUFAs和低胆固醇”的培养脂肪提供了创新的方法。
02：图文赏析
不同磷脂对猪FAPs分化的影响
猪FAPs从仔猪肌肉中分离出来。磷脂是肉制品中重要的脂质成分之一，与肉的营养价值和风味密切相关。其中，PC、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）是猪肉中的主要磷脂。然而，磷脂对培养肉的生产效率和营养价值的影响尚不清楚。在2D培养条件下，FAPs扩增至90%融合率后，用胰蛋白酶消化并播种在12孔细胞培养板上。扩增后，细胞被诱导进行脂肪生成分化，依次在诱导培养基（IM）中培养4天，然后在分化培养基（DM）中培养3天（图1A）。在分化过程中，分别添加了PC、PS和PI，每种磷脂的浓度分别为1 μM、10 μM和100 μM。使用油红O染色检测细胞中的脂质积累，100 μM PC组显示出最高的脂滴积累，表明其在促进FAPs脂肪生成分化中效果最佳（图1B）。确实，PC处理后脂质积累显著增加，如图1C-D所示的油红O染色。此外，我们还观察到PC处理组脂滴的大小增加，如图1C所示的尼罗红染色。统计分析表明，PC处理后脂滴的大小显著增大（图1E）。FAPs中的总甘油三酯含量在PC处理后也显著增加（图1F）。这些结果表明，100 μM PC的添加促进了FAPs的脂肪生成分化和脂质积累。一致地，与脂肪生成相关的基因，如类固醇调节元件结合蛋白1（Srebp 1）、脂联素（Adipoq）、脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）和脂滴蛋白1（Plin1）的mRNA水平在100 μM PC组中显著上调（图1G）。与对照组相比，PC处理还显著上调了PLIN1和FABP4蛋白水平（图1H-I）。接下来，我们进一步探讨了PC对猪FAPs增殖的影响。在2D培养条件下，FAPs扩增至90%融合率后，用胰蛋白酶消化并以每孔5000个细胞的密度播种在12孔板上。经过48小时的PC处理后，我们用Ki67抗体标记增殖细胞。我们没有观察到PC组和对照组之间Ki67阳性细胞比例的显著差异（图1J-K）。一致地，PC对增殖相关基因的表达水平，包括p21、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、细胞周期蛋白D1（CCND1）和细胞周期依赖性激酶2（CDK2）的影响不显著（图1L）。这些结果表明，100 μM PC对FAPs的增殖没有影响。
通过装载小球藻提高PC的效果
近年来，微藻被用作天然载体来运输营养物质并提高营养利用（Zhang, et al., 2022; Zhang et al., 2023），它们丰富的营养价值使它们成为肉类替代品的强有力竞争者。受此启发，我们进一步将PC制备成纳米颗粒并装载在小球藻（Eg）中。如图2A所示，PC在溶液中自组装形成纳米颗粒，然后通过渗透压和小球藻表面的大量小孔装载形成“Eg-PC”复合物。图2B显示了PC、Eg和Eg-PC的外观。PC纳米颗粒的粒径主要分布在100纳米左右（图2C-G），大多数为球形（图2G）。与Eg共孵育后，Eg的吸收曲线和Zeta电位都发生了变化，表明PC成功装载（图2D和E）。扫描电子显微镜图像进一步证实了PC和Eg的结合。小球藻表面有明显的多孔结构（图2H），但在装载PC后，孔隙消失，表面结构显著变化（图2I）。随后，确定了Eg-PC的体外释放曲线（图2F）。在Eg中装载后，PC纳米颗粒在溶液中持续释放，0~3小时内快速释放，然后在24小时内缓慢释放。
Eg-PC促进FAPs细胞分化和脂质积累
为了进一步研究PC改进是否增强了PC对FAPs脂肪生成分化和TGs沉积的效果，我们在FAPs的分化过程中分别添加了PC、Eg和Eg-PC。我们发现，通过油红O染色观察，Eg-PC组在FAPs中的脂质沉积水平最高（图2J-K）。进一步分析了FAPs中TGs的含量。Eg-PC组显示出显著高于其他三组的TG水平（图2L）。此外，PC组和Eg组的TG水平也显著高于对照组（图2L）。有趣的是，PC处理显著降低了FAPs中的总胆固醇（TC）水平（图2M）。然而，Eg-PC或Eg对TC含量没有显著影响（图2M）。这些结果表明，Eg-PC有效地促进了FAPs中的脂质积累，但不影响胆固醇沉积，这有利于生产富含大理石纹的培养肉。
PC促进来自猪FAPs的培养脂肪中的脂质积累
基于以上结果，PC同时促进了TGs的沉积并抑制了胆固醇积累。受此启发，我们推测PC有助于生产富含大理石纹的低胆固醇培养肉。我们进一步研究了PC对3D培养中FAPs脂肪生成分化的影响，使用海藻酸钠-明胶支架生成培养脂肪组织（称为“培养脂肪”）。在生长培养基中细胞扩增2天后，FAPs转换为脂肪生成诱导培养基（IM）并培养8天，然后再次转换为脂肪生成分化培养基（DM）并培养6天（图3A）。在海藻酸钠-明胶系统中，FAPs在第7天（7 d）形成小球状体，并在第14天（14 d）变得更大且数量更多（图3B）。使用尼罗红标记脂滴以进行可视化。同样，在FAPs的脂肪生成分化过程中，第14天分化的脂滴明显大于第7天的脂滴（图3C）。与对照组相比，PC处理组的脂滴更大（图3D），表明PC促进了脂肪生成分化和脂滴扩展。与对照组相比，PC处理增加了培养脂肪中脂滴的大小（图2E）。一致地，成熟脂肪细胞标记基因的mRNA水平，如Adipoq，显著增加（图3F）。有趣的是，PC处理显著下调了与脂解相关的基因的mRNA水平，但不影响与脂肪酸氧化相关的基因的mRNA水平（图3G）。接下来，我们进一步分析了成熟脂肪细胞标记基因的蛋白水平。与对照组相比，PC处理组的PLIN1蛋白表达显著上调（图3H）。我们的结果表明，PC处理还促进了3D培养中猪FAPs的脂肪生成分化和脂质积累。通过脂肪生成诱导方法，我们最终获得了类似脂肪组织的“培养脂肪”。图3I显示了支架、第1天（1 d，未分化）的FAPs支架、第14天（14 d，未分化）的FAPs支架和培养脂肪的外观。
PC改变猪FAPs细胞的脂质组成并增加TGs的含量
为了检验PC对FAPs脂质组成的影响，我们在脂肪生成分化后进行了脂质组学分析。在这次脂质组学分析中，共鉴定出3899种脂质物种，包括669种PCs、658种TGs、497种磷脂酰乙醇胺（PEs）、217种PSs和其他脂质物种（图4A）。进一步，使用OPLS-DA模型选择显著差异脂质，变量重要性投影（VIP）>1和P值<0.05作为选择显著差异脂质的标准。控制组和PC组之间显著差异脂质以气泡图的形式呈现（图4B）。正如预期，PC组中大多数TGs的含量显著增加，Cer物种的含量也显著增加（图4B）。这些结果进一步表明，PC补充促进了FAPs细胞在脂肪生成分化过程中的脂质积累。我们进一步分析了脂质类别含量的变化。与我们之前的结果一致，作为最丰富的甘油酯，TGs的含量显著增加，而MGs的含量显著减少（图4C）。在鞘脂类中，PC补充显著增加了Cer、Her1Cer、Her2Cer和硫酸鞘氨醇（ST）的丰度（图4D）。类固醇脂和类固醇脂的丰度不受PC处理的影响（图4E-F）。有趣的是，（O-酰基）ω-羟基脂肪酸（OAHFA）的丰度显著增加（图4G）。在甘油磷脂类中，PC处理增加了PC的丰度，同时减少了LPCs、LPGs和PAs的丰度（图4H）。考虑到PC处理显著增加了TGs的丰度，我们接下来分析了与TGs相关的单个脂肪酸
3：原文链接
https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2024.110156
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