2024年，日本九州大学生物调节医学研究所器官发生与再生部门的Atsushi Suzuki作为通讯作者，在《Nature Communications》杂志发表了题为“Hepatocytes differentiate into intestinal epithelial cells through a hybrid epithelial/mesenchymal cell state in culture”的论文。
本文主要研究了在体外培养条件下，肝细胞（Hepatocytes）如何通过一种混合的上皮/间充质细胞状态（hybrid epithelial/mesenchymal cell state）分化为肠道上皮细胞。研究发现，肝细胞在培养过程中会失去其功能并退分化为祖细胞样细胞（progenitor-like cells），这些退分化的肝细胞（dediHeps）表现出一种混合的上皮/间充质表型，并且依赖于Hippo信号通路的抑制来维持其退分化状态。这些细胞能够在三维培养条件下重新聚集并分化为成熟的肝细胞，甚至展现出分化为肠道上皮细胞的潜力，能够在移植后重建结肠上皮组织。这一发现对于研究和治疗肝脏中的肠道化生及相关疾病具有重要意义。
01：摘要
肝细胞在肝脏中起着重要作用，但在培养中，它们会立即失去功能并去分化为祖细胞样细胞。尽管这一独特特征是众所周知的，但肝细胞去分化的动力学和机制以及去分化肝细胞（dediHeps）的分化潜力需要进一步研究。在这里，我们采用专门为肝祖细胞建立的培养系统来研究肝细胞去分化。我们发现，肝细胞以混合上皮/间充质表型脱分化，这是诱导和维持脱iHips所必需的，并且在抑制Hippo信号通路后表现出波形蛋白依赖性增殖。dediHeps通过形成聚集体重新分化为成熟的肝细胞，从而能够在体内重建肝组织。此外，dediHips具有意想不到的分化潜力，可以在三维培养中形成类器官，并在移植后重建结肠上皮细胞。这种显著的可塑性将有助于研究和治疗肝脏肠化生和相关疾病。
02：图文赏析
培养中肝细胞源性细胞的扩增
我们将白蛋白（Alb）基因组基因座表达可诱导型Cre重组酶（CreERT2）的小鼠[Alb-CreERT2小鼠20]与R26RYFP/YFP报告小鼠21杂交。在双突变小鼠中，三苯氧胺（TM）的给药永久标记了Alb阳性肝细胞，并能够追踪它们的命运。为了观察培养中的肝细胞，我们从TM处理的Alb-CreERT2的肝脏中分离出它们；R26RYFP/+小鼠，连续传代培养。初次接种后三小时，共免疫荧光分析显示，所有YFP阳性细胞均表达Alb和Hnf4α，但胆管细胞标志物细胞角蛋白19（CK19；也称为Krt19）未检测到YFP（图1a，b）。因此，我们开发了一种实验系统来追踪培养中肝细胞的命运，该系统涉及高度特异性的肝细胞分离及其用YFP进行遗传标记。在单层培养中，一些肝细胞的形态在接种后4天内从圆形变为纺锤形；这些细胞继续增殖，经过几周的培养后逐渐变成小上皮细胞（图1c）。这些YFP阳性肝细胞来源的细胞可以通过连续传代来维持（图1c）。两个独立的实验表明，YFP在来自TM处理的Alb-CreERT2肝脏的99%以上的培养细胞中表达；R26RYFP/+小鼠，表明其肝细胞后代可以在长期培养中增殖和扩增（补充图1a，b）。此外，与从Alb-CreERT2分离的肝细胞相似；R26RYFP/+小鼠，来自未经处理的野生型小鼠的小鼠也能够在培养物中繁殖（补充图1c）。因此，这些细胞被命名为去分化肝细胞（dediHips）。
dediHeps具有E/M杂交表型
在原代肝细胞转化为dediHeps的过程中，Alb和上皮细胞标志物E-cadherin（E-cad；也称为Cdh1）的表达得以维持（图2a）。与Alb和E-cad一起，CK19和间充质细胞标志物Vimentin（Vim）在接种后4天在纺锤形肝细胞来源的细胞中表达；它们的表达在长期dediHep培养中得以维持（图2a）。共聚焦显微镜清楚地表明，在dediHeps中，Alb和E-cad分别与CK19和Vim共表达（图2b）。这些发现表明，原代肝细胞在单层培养的早期阶段采用混合E/M表型，在从肝细胞向dediHep过渡期间和之后保持这种表型。Cdh1和上皮细胞标志物claudin-3（Cldn3）和occludin（Ocln）的表达水平没有变化，但与从成年小鼠肝脏新鲜分离的肝细胞中的表达相比，培养的dediHep中Vim和间充质细胞标志物S100钙结合蛋白A7A（S100a7a）和层粘连蛋白B1（Lamb1）的表达增加（图2c）。此外，增殖标志物Ki67（也称为MKi67）和胆管细胞/祖细胞标志物prominin-1（Prom1；也称为CD133）的表达相对于它们在肝细胞中的表达增加，编码肝酶的几个基因的表达减少，而dediHeps和肝细胞都表达了类似水平的参与肝细胞分化的转录因子，包括Hnf4α和Hnf1α（图2c）。京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，与细胞周期和代谢通路相关的基因分别在上调和下调的基因中富集（图2d）。肝细胞转化为dediHep期间的序列基因表达分析显示，在单层培养1天后，编码肝酶的基因表达开始下降，随后MKi67、Krt19、Prom1和间充质细胞标志物的表达增加（图2e）。综上所述，我们的数据表明，dediHips保持了肝细胞和上皮细胞的一部分关键特征，但失去了功能并获得了部分间充质表型。
dediHeps移植到损伤肝脏后，可重新分化为肝细胞并重建肝组织
为了研究再分化的潜力，我们开发了dediHep聚集培养物，因为聚集已被证明可以促进来源于多能干细胞22或直接由成纤维细胞诱导的未成熟肝细胞样细胞的成熟23。在3D培养条件下，dediHeps逐渐组装形成均匀的聚集体（图3a），表达Alb和E-cad，但既不表达Vim也不表达Ki67（图3b）。为了评估dediHep聚集体的肝脏成熟度，我们用单层对照对其进行了基因表达分析，并进行了KEGG通路富集分析。编码肝酶的基因表达增加，但MKi67、Krt19、Prom1和间充质细胞标志物的表达减少（图3c）。从3D培养1天开始，基因表达的变化被迅速诱导（补充图2）。同时，Cdh1、Cldn3、Ocln、Hnf4α和Hnf1α的表达水平在聚集体和单层之间几乎没有变化（图3c）。KEGG途径富集分析显示，与单层相比，dediHep聚集体中差异表达的基因在与代谢途径（上调）和细胞周期（下调）相关的基因中显著富集（图3d）。在长期单层培养中繁殖的dediHep也可以诱导dediHep聚集体的肝脏成熟（补充图3）。为了确定dediHep衍生的再分化肝细胞是否可以重建肝实质，我们在脾内注射了TM处理的Alb-CreERT2的解离聚集体；R26RYFP/+小鼠进入富马酸乙酰乙酸水解酶（Fah）缺陷型（Fah-/-）受体小鼠的肝脏，这是一种I24型遗传性酪氨酸血症小鼠模型。如果不提供2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）1,3-环己二酮（NTBC），Fah-/-肝脏会严重受损；因此，这些小鼠可以作为受体来分析肝细胞分化潜力和肝组织重构。移植三个月后，dediHep衍生的YFP阳性细胞将Fah-/-受体的肝组织重建为Fah阳性肝细胞，在形态上与正常肝细胞无法区分（图3e）。这些来源于dediHep的肝细胞不表达间充质细胞标记Vim和α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）（补充图4）。dediHep来源的肝细胞的组织重建能力与从成年小鼠肝脏新鲜分离的肝细胞相似（图3f）。这些数据表明，聚集消除了dediHeps中的间充质表型，并促进了向生长停滞、功能性肝细胞的再分化。
dediHeps在单层培养中具有肠道表型
鉴于dediHips是具有混合E/M表型的未分化细胞，我们想知道它们是否能够分化成其他细胞类型。我们发现，超过60%和90%的dediHeps分别表达肠主转录因子Cdx2及其mRNA（图4a，b），通常在肠上皮细胞中表达，但在肝细胞中不表达。Cdx2与Alb在dediHeps中共表达（图4c），并在再分化为肝细胞的过程中逐渐从dediHeps消失（补充图5）。在发育过程中，骨形态发生蛋白（BMP）信号传导是定形内胚层形成/后肠规范的关键，诱导Cdx2表达和肠的命运25,26。此外，BMP靶基因分化抑制剂（Id）2在发育中的胃中的异位表达诱导了胃上皮中的Cdx2阳性肠上皮细胞27。因此，我们研究了在dediHeps中，BMP信号是否被激活，对Cdx2的表达是否至关重要。肝细胞转化为dediHep期间的序列基因表达分析显示，dediHep中BMP4、BMP7和BMP靶基因Id1和Id2的表达增加（图4d）。此外，Noggin对BMP信号传导的抑制显著抑制了dediHeps中Cdx2的表达水平（图4e）。这些数据表明，dediHeps在单层培养中通过激活BMP信号表达Cdx2。dediHips在移植后分化为肠上皮细胞，重建结肠上皮。Cdx2在dediHeps中的表达表明它们可以分化为肠内皮细胞。为了验证这一假设，我们将dediHips嵌入Matrigel 3D培养物中，并在Wnt3a和Wnt激动剂CHIR99021（糖原合酶激酶-3抑制剂，指定为WCENR）存在的情况下用表皮生长因子（EGF）、Noggin和R-spondin1（指定为ENR）对其进行处理，CHIR9902 1诱导胎儿肠祖细胞（FIPC）形成球形类器官（SO）28。经过11天的培养，dediHeps形成了少量的SO，可以通过连续传代繁殖（图5a）。在SO形成和传代后，Cdx2的表达水平升高，Alb和Vim的表达水平降低（图5b）。这些SO由积极增殖、极化的肠上皮细胞组成，这些细胞在基底外侧表达E-cad，在顶部表达Villin（也称为Vil1），在细胞核中表达Cdx2和Sox9（图5c和补充图6a），类似于FIPC衍生的SOs28,29。此外，表达CK19和Hnf4α但不表达Alb的细胞形成了dediHep衍生的SO，表明这些SO不是表达CK19但不表达Hnf4β和Alb的胆道类器官（补充图6b）。全球基因表达分析显示，与肝细胞相比，在dediHep衍生的SO或FIPC衍生的SO中特异性表达的基因是相似的（图5d），97%以上的检测基因在两种类型的SO中表达相似（图5e）。此外，在培养基中添加含有或不含有囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）抑制剂CFTRinh-172的福司可林（FSK）分别阻断或诱导了dediHep衍生的SO的肿胀（补充图7）。因此，形成dediHep衍生的SO的上皮细胞可以以CFTR依赖的方式对FSK作出功能性反应，并增加SO的大小
dediHeps部分类似于化学诱导的肝祖细胞(CLiPs)，但在许多方面有所不同
小分子化合物，如Rho相关激酶抑制剂Y-27632、TGF-βI型受体抑制剂A-83-01和CHIR99021，在无血清单层培养中允许肝细胞去分化，所得细胞被命名为CLiPs12。为了比较dediHips和CLiPs，我们按照已发表的方案培养成年小鼠肝细胞，并诱导肝细胞去分化为CLiPs。CLiPs需要几个月的时间才能充分增殖，而dediHips只需要几周的时间。事实上，CLiPs的增殖能力明显低于dediHips（补充图10a）。CLiPs在形态学上被鉴定为上皮细胞，表达Alb、CK19、E-cad和Vim，与dediHips相似（图7a），表明CLiPs也具有混合E/M表型。全球基因表达分析显示，Cdh1、Cldn3、Ocln、Vim、Prom1、Hnf4α和Hnf1α的表达水平相似，但S100a7a、Lamb1、Mki67和Krt19在CLiPs中的表达水平低于它们在dediHps中的表达（图7b）。同时，与dediHeps中的表达相比，CLiPs中编码肝酶的几个基因高度表达，Cdx2的表达水平显著降低（图7b）。除PROM1、MKI67和KRT19外，人肝细胞去分化为CLiPs14还可以激活间充质细胞标志物VIM和LAMB1的表达（补充图10b）。因此，CLiPs部分类似于具有混合E/M表型的dediHps，但比dediHps具有更多的肝细胞特征。为了评估本研究中分析的各种类型细胞之间的关系，我们研究了这些细胞中的全局基因表达谱，并进行了主成分分析（PCA）（图7c）。PCA显示，单层培养1天后，肝细胞的基因表达特征发生了广泛变化，并且随着培养的进行，其基因表达特征逐渐接近dediHips。CLiPs的基因表达特征与培养1周的肝细胞最相似。细胞聚集形成后，dediHeps的基因表达特征接近单层培养几天的肝细胞。Matrigel 3D培养物中SO的形成使dediHips的基因表达特征远离肝谱系细胞的基因表达，使其更接近FIPC衍生的SO。此外，dediHep衍生的BO和ISC衍生的BO占据了相似的维度空间，表明两种不同类型BO的基因表达特征非常相似。
3：原文链接
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47869-2
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