遇见/摘要
β-位具有取代基的氨基酸是一类广泛存在于活性天然产物中的重要非天然氨基酸，已被证明其β位引入取代基团能够显著提高化合物的生物活性。然而，由于该类氨基酸包含两个连续的手性中心，其立体选择性合成一直是化学合成领域的难题。传统的化学合成方法通常依赖不对称催化，但其往往伴随着过渡金属催化剂的过度使用、反应路径冗长、产率较低等问题，限制了其实际应用。在绿色合成的背景下，生物催化成为了一种有潜力的替代方案。然而，目前已报道的生物催化方法大多依赖转氨酶和甲基转移酶，这些酶系不仅需要辅因子，还需要复杂的辅因子再生系统，增加了反应体系的复杂性，限制了其工业化应用。
近日，Greifswald大学Uwe T. Bornscheuer教授课题组与华中科技大学孙宇辉教授/翟贵发团队合作，通过酶工程改造苯丙氨酸裂解酶（PcPAL），利用全细胞转化方法，实现了对β-位取代的肉桂酸及其类似物的直接不对称氨化反应。这一方法不仅具有极高的立体选择性和较好收率，而且避免了对辅因子的依赖，简化了生物转化过程。相关成果以“Direct asymmetric synthesis of β-branched aromatic α-amino acids using engineered phenylalanine ammonia lyases”为题，发表在国际著名期刊Nature Communications上。
遇见/内容
苯丙氨酸裂解酶（PAL）是一类能够可逆催化苯丙氨酸脱氨反应的酶，其介导的可逆反应已被广泛用于多种苯丙氨酸类似物的合成中。然而经过对该类酶的多年研究，普遍认为PAL难以β-位取代的氨基酸的合成。在该研究中，研究人员首先利用cMD, QMMM等计算机模拟手段, 以Petroselinum crispum来源的PAL （PcPAL）为研究对象，对其不能转化β-甲基肉桂酸（β-MeCA）的原因进行了分析，通过与野生型底物肉桂酸（CA）的模拟结果相比，发现β-MeCA所在的口袋体积，关键的氢键角度，以及关键的氨基酸成键方式存在差异 (图1)，提出了底物定位动态是影响PcPAL转化β-MeCA的原因，为下一步理性改造提供了思路。
根据计算机模拟结果，研究人员将活性口袋周围的8个氨基酸理性改造为位阻较小氨基酸（A, V, G），并通过组合突变，发现PcPAL-L256V-I460V突变体能够较好的转化β-MeCA （图2 a, b），并且研究人员利用两种不同的方法验证了产物的立体构型（图2 c，d），证明产物β-甲基取代苯丙氨酸（β-MePhe）的立体构型为（2S,3R）。
为了提高反应效率，研究人员构建了全细胞转化系统并对不同的β-MeCA类似物进行了转化，通过核磁验证，Marfey试剂衍生化以及X-单晶衍射方法，对每个产物进行了结果鉴定，最终以极高的立体选择性（dr >20:1, ee>99.5%）和中等收率（41%-71%）得到了10个β-MePhe类似物 （图3）。
最后，作者对PcPAL-L256V-I460V突变体能够转化β-MeCA的分子基础进行了研究，通过与（PcPAL-WT）/（CA）复合物以及（PcPAL-WT）/（β-MeCA）复合物的模拟结果进行比对，发现（PcPAL-L256V-I460V）/（β-MeCA）复合物的模拟结果与（PcPAL-WT）/（CA）复合物的模拟结果在关键氢键角度，活性口袋体积大小以及氢键成键形式方面高度相似 （图4），证明突变体恢复了β-MeCA底物正确的底物定位动态。
综上，通过改造苯丙氨酸裂解酶，该项研究为绿色、高效合成β取代苯丙氨酸类似物提供了新的解决思路。
该项研究得到了欧盟地平线2020研究与创新计划，华中科技大学人才引进基金的支持。Greifswald大学博士后孙成海，华中科技大学药学院翟贵发，Greifswald大学Uwe T. Bornscheuer教授为本文的共同通讯作者。衷心感谢华中科技大学孙宇辉教授，上海医工院奕栋研究员，中科院北京化学所敖宇飞副研究员，华中农业大学吴淑可教授，Greifswald大学韦韧博士，华中科技大学博士研究生陆根以及吴亚的大力支持。
遇见/致谢
1. 上交大瞿旭东组Angew｜酶工程改造P450酶实现吡咯并吲哚类生物碱的集约式生物合成
2. 上海交大瞿旭东组NPR｜吡咯并吲哚类生物碱的生物合成综述
3. 上交大瞿旭东组Nat Com | 细菌P450催化二酮哌嗪底物区域/立体选择性异源二聚的分子基础
4. 中科院化学所敖宇飞/格赖夫斯瓦尔德大学Bornscheuer合作Angew｜建立转氨酶催化性能预测模型并用于数据驱动的蛋白质工程
5. 德国Greifswald大学Uwe T. Bornscheuer组Angew｜改性聚（乙烯醇）的合成及其酶法级联的降解
本期参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-52613-x
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
