细菌来源芳香聚酮类化合物具有显著的生物活性，如临床使用的抗生素四环素和抗癌药物柔红霉素。这类化合物由II型PKS催化合成，其起始单元通常为乙酰辅酶A，少数情况下也可利用丙酰辅酶A、丁酰辅酶A或短链脂肪酰基作为起始单元(图1A)。这些非常规起始单元的引入需要额外的3-酮酰基ACP合成酶(KAS III)介导。在II型PKS途径中，KAS III负责选择特定的非常规起始单元进入装配线，可增加芳香聚酮的结构多样性，例如，高选择性DNA烷基化试剂hedamycin的起始单元是一个由迭代的I型PKS合成的己烯酰基单元，再由KAS III介导引入II型PKS装配线。目前这类I/II型PKS杂合基因簇十分罕见，因此研究人员针对这类基因簇进行挖掘。
首先，对NCBI公共数据库和本地自有菌种数据库中的放线菌基因组进行分析，从中获得了5,944个II型PKS基因簇。针对具有非常规起始单元的基因簇进行挖掘，筛选确定了919个包含KAS III的II型PKS基因簇。通过对这些候选基因簇的深入分析，从Micromonospora sp. HM134和Streptomyces spectabilis NA07643中发现了2个同源基因簇msp和spi。生信分析显示msp和spi基因簇内都含有I型PKS、II型PKS以及KAS III基因(图1B)，表明两个基因簇可能合成含有新颖起始单元的芳香聚酮。
随后，对Micromonospora sp. HM134和Streptomyces spectabilis NA07643进行发酵检测，发现S. spectabilis NA07643在RM发酵培养基中能产生5个产物(1-5)，敲除KS的突变株ΔspiA则无产物生成，证实这些产物与spi基因簇相关(图2A)；而M. sp. HM134菌株在多种培养基上均无产物。对S. spectabilis NA07643进行20 L放大发酵，分离获得了化合物1-5。通过HRESIMS、NMR和X-射线单晶衍射等方法鉴定了1-5的化学结构(图1C)，并根据结构推测5个化合物的起始单元均来自I型PKS合成的三酮单元，其中1是具有两对独特螺环结构的新颖蒽醌型聚酮二聚体，2-5是不含螺环结构的单体化合物。喂养2-5至ΔspiA突变株中，仅在2和3中观察到能转化为1，表明2和3为1的生物合成中间体，4和5为代谢副产物。抗菌活性测试表明，仅1对Micrococus luteus ATCC 4698具有抑制活性(MIC为2 μg/mL)。
接着，通过体内基因敲除、中间体分离鉴定和体外生化反应等实验阐明了1的生物合成途径(图1C, 2和3)：①I型PKS(SpiI)与反式的KR(SpiK)和ER(SpiE)协同合成三酮起始单元(2,4-二甲基-4-己烯酰基)，KAS III(SpiD)进一步将该起始单元引入II型PKS装配线，经过8轮延伸、环化形成中间体6(图1C和2A，体内敲除验证)；②甲基转移酶SpiM1、环化酶SpiC2和甲基转移酶SpiM2依次对6进行甲基化、环化和甲基化而生成中间体2(图1C和2，体内敲除和体外生化验证)；③P450酶SpiP1氧化2的末端甲基生成醛基，进而引发分子内的Michael加成反应形成含螺环结构的中间体11/11'，酮基还原酶SpiK1催化11/11'的末端醛基还原成羟基生成中间体12/12'(图1C，2和3C，体内敲除和体外生化验证)；④P450酶SpiP2进一步催化12/12'发生二聚化反应得到15(图1C和2A，体内敲除验证)；⑤黄素单加氧酶SpiF催化底物中的萘环发生氧化，经过互变异构进而引发分子内的Michael加成反应形成第二对螺环，最终生成1(图2, 3A和3B，体内敲除和体外生化验证)。
综上所述，本研究通过基因组挖掘发现了罕见的同时包含I/II型PKS和KAS III的基因簇，鉴定了含螺环结构和独特起始单元的芳香聚酮二聚体化合物spirocycline A，阐明了其复杂的生物合成途径，解析了参与螺环和二聚化形成的4个氧化还原酶功能，为后续生物催化的应用奠定了基础。此外，本研究中对II型PKS基因簇的挖掘是以非常规起始单元(KAS III)为抓手，该策略有别于前期文献报道的以链长决定因子和氧化还原酶为探针的挖掘，为其它PKS和NRPS生物合成基因簇的挖掘提供了借鉴。
本文共同通讯作者是南京大学戈惠明教授、焦瑞华教授和史净特任研究员团队，团队主要围绕微生物中天然产物的发现、生物合成、组合生物合成以及生物功能等开展研究。
