为阐明狼毒大戟中复杂半日花烷衍生型二萜药效成分群的形成机制,团队对狼毒大戟进行转录组测序,通过同源比对和进化树分析,筛选到1个TPS-c家族的萜合酶EfTPS54以及4个TPS-e/f家族的萜合酶EfTPS14、EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43。功能表征结果表明,EfTPS54为II型二萜合酶ent-copalyl diphosphate合酶,EfTPS14、EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43分别为I型二萜合酶ent-neoabietadiene合酶、ent-kaurene合酶、ent-isopimara-7(8),15-diene合酶和ent-atiserene合酶。这五个二萜合酶的产物涵盖了狼毒大戟中所有半日花烷衍生型二萜的骨架类型。
图1. 二萜合酶EfTPS54、EfTPS14、EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43功能表征
岩大戟内酯类成分(松香烷型骨架)是其中抗肿瘤活性最显著的化合物,其结构特征包括:具有C-13和C-15之间的双键以及在C-8和C-14之间具有双键、环氧基或邻二醇官能团。因此,推测岩大戟内酯类成分的前体为ent-neoabietadiene而非其它松香烷型萜烯。EfTPS14主要产生松香烷型二萜ent-neoabietadiene,同时也产生痕量的海松烷型二萜ent-sandaracopimaradiene和松香烷型二萜ent-abietadiene,因此是首个产物专一的ent-neoabietadiene合酶。综上,无论从岩大戟内酯类成分的形成机制上讲,还是新颖酶学机制上讲,阐明EfTPS14的催化机制都具有重要意义。
团队进一步对EfTPS14进行多尺度模拟和定点突变实验,阐明EfTPS14催化海松烷型碳正离子中间体IM1转化为松香烷型碳正离子中间体IM3的机制是由主链介导和中性中间体参与的去质子化-再质子化协同甲基转移,主要包含以下四个证据:(1)EfTPS14的产物中检测到痕量的中性中间体ent-sandaracopimaradiene(IM2),说明IM1发生去质子化;(2)EfTPS14活性口袋中所有碱性残基的突变均不影响IM1去质子化生成IM2;(3)质子从C14直接迁移到C-16所需跨越的能垒(25.1 kcal/mol)远高于主链介导的去质子化-再质子化过程;(4)EfTPS14的G1/2 break区域的I644主链上的羰基发挥双功能,既可以作为碱来抽取质子,产生中性中间体IM2,又可以作为酸使IM2质子化。同时,I644A突变导致突变体保留抽取质子的功能,但失去传递质子的功能,即主产物从ent-neoabietadiene转变为ent-sandaracopimaradiene。
图2.推测的ent-neoabietadiene合酶催化机制
图3. ent-Neoabietadiene合酶QM/MM计算和定点突变
接着,作者对来自Setaria italica的ent-海松烷/松香烷型二萜合酶SiTPS8的G1/2 break区域的同源位点I449和A450进行突变,结果证明这种由主链介导的去质子化-再质子化过程可能普遍存在于涉及中性中间体的二萜合酶级联反应中。
此外,作者筛选到L765和L762两个位点对于IM3从C-15区域选择性去质子化生成ent-neoabietadiene至关重要。L765F/L762S双突变体使EfTPS14完全转变为ent-abietadiene合酶。
本研究通过筛选和表征狼毒大戟中的二萜合酶,首次阐明狼毒大戟复杂半日花烷衍生型二萜药效成分群的关键形成机制。通过多尺度模拟技术结合定点突变实验,首次解析ent-neoabietadiene合酶的由主链介导和中性中间体参与的去质子化-再质子化的催化机制,并鉴定关键的氨基酸位点,阐明了狼毒大戟中半日花烷衍生型二萜骨架形成的关键酶学机制。本研究为狼毒大戟复杂药效成分群形成机制的解析奠定基础。
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c05274
中国医学科学院药物研究所訾佳辰研究员、中山大学巫瑞波教授和中国医学科学院药物研究所助理研究员朱建勋为论文的共同通讯作者。中国医学科学院药物研究所博士后高可和中山大学博士生徐康为是论文共同第一作者。本研究得到国家自然科学基金、中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费项目、中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金等项目的资助。
訾佳辰研究员任天然药物活性物质与功能国家重点实验室课题组长,本课题组长期从事中药药效成分群的异源生物合成和形成机制的研究。目前,已实现檀香挥发油的克级生物制备,所产挥发油的分子比例可媲美濒危优质印度产檀香挥发油,已完成中试放大并实现转化。近年来,在Nat. Commun.、Acta Pharm. Sin. B、ACS Catal.和Metab. Eng.等期刊发表论文20余篇。
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本文转载自公众号中国植物学会药用植物专委会