01
遇见/摘要
色氨酸作为一种关键氨基酸，不仅是蛋白质合成的基础构件，更是众多高价值化学品的重要前体。尽管目前已存在一些对色氨酸响应的生物传感器，但人们对于开发高性能生物传感器的兴趣却愈发浓厚。在此项研究中，作者以tnaCAB 操纵子的前导调控区为基础，构建了一个色氨酸生物传感器的微型工具包。通过对 tnaC 前导序列进行工程改造，产生了四种突变体。随后，在基于MazEF 毒素—抗毒素系统的报告菌株中，对天然tnaC序列及其突变体的性能进行了评估。其中两种突变体对低水平的色氨酸表现出了更高的灵敏性，并将其应用于提高紫色杆菌素的生物合成予以验证。此外，通过用噬菌体衍生的组成型启动子替换天然 tnaC 启动子，进一步优化了该生物传感器。同时，还可以将色氨酸生物传感器与恶臭假单胞菌启动子组装，并将其拓展到恶臭假单胞菌中用于紫色杆菌素的动态合成。本研究丰富了色氨酸生物传感器的工具包，可广泛应用于许多其他高价值色氨酸衍生产品的生物生产中。
02
遇见/内容
生物传感器是合成生物学的重要工具，能够极大地加快微生物细胞工厂的构建进程。利用生物传感器对宿主内代谢途径进行动态调控，可使微生物具备更高的生产效率。虽然目前已有众多成功应用代谢物生物传感器的案例，但要实现其广泛应用，仍需进一步开发高性能的生物传感器并将其应用于代谢产物的生物合成。
基于MazEF毒素-抗毒素系统报告菌株的构建。为了评估色氨酸生物传感器的性能，借助利用大肠杆菌中常用的鼠李糖诱导系统，并结合MazEF毒素-抗毒素模块构建了报告菌株BL21-DmazE（图1A）。在未添加鼠李糖的情况下，mazF不进行转录，细胞得以存活。当添加鼠李糖时，MazF 毒素被诱导产生，以剂量依赖的方式导致细胞死亡（图1B）。为测量诱导的动态范围，在添加了不同浓度鼠李糖的LB液体培养基中分别培养BL21和BL21-DmazE。结果显示，当培养4 h、6 h和8 h时，BL21-DmazE的细胞生长随着鼠李糖浓度的增加而逐渐降低（图1C）。由此得出结论，报告菌株BL21-DmazE在鼠李糖诱导条件下表现出明显的生长停滞现像。然而，在BL21中没有观察到类似的情况。此外，作者还进行了细胞活力测定。结果表明，在鼠李糖存在的情况下，BL21-DmazE表现出明显的生长停滞，尤其是当鼠李糖添加较高浓度时（图1D）。
天然色氨酸生物传感器的评估。为了测试报告菌株的可行性，色氨酸生物传感器可用于驱动mazE的表达而导致产生抗毒素 MazE，并且在鼠李糖存的情况下中和 MazF毒素，BL21-∆mazE从生长停滞到恢复正常生长。本文基于 tanCAB操纵子的天然先导调节区域的生物传感器展开，涵盖启动子、先导序列和Rho依赖性终止子（图 2A）。作为对照，分别使用了无启动子的mazE和T7启动子驱动的 mazE。随后，将这三种构建导入 BL21-∆mazE 中获得 BL21-mazE、BL21-tnaC-mazE 和 BL21-T7-mazE。由于mazE编码抗毒素MazE的产生拮抗MazF毒素，从生长停滞到恢复正常生长（图2B）。结果显示，与BL21-mazE 的生长表型相比，BL21-T7-mazE 观察到菌株明显恢复正常生长（图2C）。BL21-tnaC-mazE 也观察到类似的现象，尽管其生长水平没有达到 BL21-T7-mazE的程度（图2C）。结果表明，在鼠李糖诱导条件下，tnaC 调节序列可以感知细胞内色氨酸并促进 MazE 抗毒素的产生，以恢复菌株的正常生长。
高性能色氨酸生物传感器的构建及其表征。接下来，为了扩大色氨酸生物传感器的动态范围和灵敏度，作者对tnaC调控序列进行了工程改造。在以往的研究中，已经确定了一些 TnaC变体。包括位置 21（D21T）、23的突变和位置 23（R23H 和 R23F）的突变，在位置24之后插入罕见的异亮氨酸密码子 AUA 增加了游离色氨酸与核糖体的结合。因此，将改造后的tnaC替换天然tnaC调控序列，获得了四个突变体（图3A）。接下来，将这些构建转入BL21-mazE-tnaCA中，在鼠李糖诱导条件下，通过菌株生长的情况来评估色氨酸生物传感器的性能。所有菌株都接种于添加不同浓度色氨酸的 LB 液体培养基中，分别培养 4 h、6 h 和 8 h。对于 BL21-tnaC-mazE，在较高浓度的色氨酸存在下观察到明显的恢复生长（图3B）。结果表明生物传感器可以感知色氨酸信号，进而激活 mazE 的表达以恢复细胞生长，将其命名为 L-TrpBioSen。与 BL21-tnaC-mazE 一样，BL21-25I-mazE 观察到明显恢复生长，而 BL21-D21T-mazE 没有类似的现象（图3B）。BL21-R23H-mazE 也观察到轻微的生长恢复，而BL21-R23F-mazE 没有观察到明显的恢复生长现象（图3B）。本文进一步进行了细胞活力测定，结果表明，与 L-TrpBioSen 一样，所有突变体都感知色氨酸信号并激活 mazE 的表达以恢复细胞生长（图3C）。在突变体中，第23位的突变，L-TrpBioSenR23F 和 L-TrpBioSenR23H，在恢复生长实验中效果更好，而 L-TrpBioSenR21T 和 L-TrpBioSen25I 则不如L-TrpBioSen（图3C）。基于这些发现，作者随后将重点放在 L-TrpBioSenR23F 和 L-
图3 色氨酸生物传感器的系统表征。
生物传感器用于调控紫色杆菌素的动态合成。本文基于tnaC及其变体构建了三个色氨酸生物传感器用于驱动紫色杆菌素基因簇 vio BGC 的表达，以大肠杆菌 BL21 Star（DE3）为底盘菌株合成紫色杆菌素。首先通过测量 OD570来测定紫色杆菌素的产量，结果表明，当 vio BGC 被置于 L-TrpBioSenR23F 和 L-TrpBioSenR23H 的控制下时，紫色杆菌素的产量增加（图4A）。接下来，作者创建了两株不同色氨酸产量的重组菌株（BL21-lo和BL21-Hi））来展示体内色氨酸生物传感器的动态范围。当在两个不同拷贝数 pET23b与 pSET152 系列中表达时，L-TrpBioSenR23H 的性能优于 L-TrpBioSen，HPLC 定量观察到类似的紫色杆菌素产量趋势（图4B）。值得一提的是，pSET152 相关构建观察到紫色杆菌素的最大产量明显低于 pET23b相关构建，表明质粒拷贝数对紫色杆菌素生产具有影响。为了进一步检查质粒拷贝数对紫色杆菌素合成的影响，本文使用诱导拷贝数质粒（pTrig）开展了研究。添加IPTG诱导质粒拷贝数增加，观察到紫色杆菌素明显渗漏表达。为了解决这个问题，将lac 启动子替换为鼠李糖诱导启动子。随着鼠李糖浓度的增加，观察到底盘菌株中紫色杆菌素产量的逐渐增加，并观察到 0.2% 的鼠李糖诱导效果更好（图5B），结果表明诱导质粒拷贝数控制有助于灵活控制紫色杆菌素的生产。
图4 色氨酸生物传感器用于紫色杆菌素的动态合成。
图5 质粒拷贝数对紫色杆菌素生产的影响。
色氨酸生物传感器在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中广泛应用。为了扩大这些色氨酸生物传感器的使用，本文通过用噬菌体衍生的pL 启动子替换tnaC操纵子前的天然启动子进行了进一步的优化，与原始启动子构建相比，观察到改造后的生物传感器显著增加了紫色杆菌素的产量（图6A）。此外，作者将tnaC原始启动子替换为假单胞菌常用启动子，实现了紫色杆菌素在恶臭假单胞菌 KT2440 中的动态合成（图6B）。因此，通过与其他细菌启动子结合，这些色氨酸生物传感器的性能可以进一步提高，且可以扩展应用于大肠杆菌以外的细菌。
综上所述，本文成功构建了四个色氨酸生物传感器突变体，并通过分子改造获得性能优良其具有广泛适用性的色氨酸生物传感器，丰富了色氨酸生物传感器的工具包，能够广泛应用于大肠杆菌和假单胞菌的基因表达调控以及重要次级代谢产物的生产。
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遇见/致谢
感谢牛国清老师课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
1. 西南大学牛国清组ACS SynBio｜链霉菌鼠李糖诱导表达系统的创制与应用
2. 西南大学牛国清组ME | 应用组合代谢工程策略大幅提高天然除草剂莎斯托明的产量
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遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
