近日，《Proceedings of the National Academy of Sciences》在线发表了生命科学技术学院瞿旭东课题组与武汉大学张郑宇课题组、厦门大学王斌举课题组的合作成果，题为“A nucleobase-driven P450 peroxidase system enables regio- and stereo-specific formation of C‒C and C‒N bonds”。本文的共同第一作者为生命学院博士后魏广证、武汉大学博士生段博瑞和厦门大学博士生周太平；共同通讯作者包括瞿旭东教授、张郑宇教授和王斌举教授。
细胞色素P450酶被誉为“万能生物催化剂”，在药物代谢、合成及生物制造中发挥着重要作用。传统上，P450酶需要氧气，并将其转化为活性物种Compound I（CpdI），之后再进行加氧反应（如羟化、环氧化等），或通过自由基驱动的C-C/C-X键形成与断裂反应（如偶联、断裂和重排等）。然而，P450酶在活化氧气时常需使用昂贵的辅因子（如NADPH）及复杂的电子传递辅助蛋白，这限制了其实际应用。部分P450酶因能利用廉价的H₂O₂形成CpdI而受到关注，但大多数只能催化简单的加氧反应（称为P450 peroxygenases，过加氧酶），而催化单电子氧化生成自由基无加氧过程的P450 peroxidase (P450过氧化物酶)则相对罕见，该类活性通常催化化合物骨架C-C/C-N键的形成（图1A）。尽管已有方法将普通P450酶改造成P450过氧化物酶，但成功案例少，且催化的多为简单反应。这主要归因于P450过氧化物酶的活性尚未被充分挖掘，以及对其催化机制的理解不足。因此，深入探索天然P450过氧化物酶的催化机制，将有助于开发更具前景的酶促反应体系。
在前期研究中，瞿旭东课题组发现了首个能催化含色氨酸二酮哌嗪（TDKP，图1B）二聚化形成吡咯并吲哚生物碱的P450酶（Nat Commun 2018, 9, 4428），并阐明了其独特的催化机制（Nat Commun 2020, 11, 6251），从而大幅度拓展了此类P450酶的底物谱，实现了上百个活性吡咯并吲哚生物碱的生物合成（Angew Chem Int Ed 2023, 62, e202304994），并提出了此类生物碱的新分类方法（Nat Prod Rep, 2022, 39, 1721）。
在本研究中，研究团队采用进化关系导向的基因组挖掘策略，从细菌中鉴定出一种新的P450酶（PtmB）。该酶能够催化三种天然的嘌呤核碱基（鸟嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤）与TDKP发生异源二聚化反应，生成独特的C3-核碱基吡咯并吲哚及核碱基-TDKP二聚体生物碱。与依赖于NAD(P)H辅因子及电子转移系统的典型TDKP二聚化P450合成酶不同，PtmB及其同源蛋白能够利用H₂O₂催化腺嘌呤及其他带有6-氨基的嘌呤核碱基与TDKP反应，展现出罕见的过氧化物酶活性。
通过对多个PtmB-底物复合物的晶体结构解析、定点突变分析和QM/MM计算，研究团队深入揭示了PtmB独特的催化机制，发现腺嘌呤在PtmB过氧化物酶活性中的独特双重功能：既作为反应的底物，又作为酸碱催化剂激活H₂O₂转化为催化中间体Cpd I。进一步的底物类似物活性测试、定点突变以及分子动力学模拟结果表明，腺嘌呤6位上的NH₂取代基通过参与广泛的氢键网络（图1D），对形成有利于H₂O₂活化的核碱基构象至关重要。分子动力学模拟还表明，环二肽TDKP具有灵活的构象转变，这进一步促进了C-C和C-N键形成吡咯并吲哚结构的立体和区位选择性合成。
该项研究揭示了首个以底物-核碱基驱动的P450过氧化物酶催化体系，并且是已知能够催化的最复杂化学反应的P450过氧化物酶，能够立体和区位选择性构建C-C和C-N键，合成复杂天然产物骨架。核碱基作为DNA和RNA的基础单元，同时在部分核酶（RNA）的功能中充当关键酸碱催化子，本研究创新性地发现了核碱基在P450过氧化物酶催化中作为酸碱催化剂的新功能。这一发现有望为新型P450过氧化物酶及基于核碱基的生物催化剂的开发奠定重要基础。
图 1. P450-H2O2活性及其机制。
（A）典型的 P450 过加氧酶和过氧化物酶的活性比较。
（B）P450 过加氧酶和过氧化物酶中活化H2O2的酸碱催化机制。
（C）一些代表性的TDKP二聚体及TDKP核碱基二聚体天然产物。
（D）本研究发现的核碱基催化机制。
该研究工作得到了国家自然科学基金面上项目、青年项目以及博士后面上基金的支持。
