引言
木质纤维素是一种廉价且丰富的可再生资源，是绿色生物制造合成生物燃料和化工产品的重要原料，但目前基于木质纤维素生物质的生物炼制一直未能大规模推广应用。整合生物加工(Consolidated bioprocessing，CBP)技术把糖平台和发酵合并到一个反应器中进行，实现了纤维素酶生产和分泌、纤维素全组分水解以及化学品的生物合成的同时进行，具有集成化和简约化的优点。因此，CBP被认为是另外一种值得探索的木质纤维素生物质生物炼制路线。山东大学微生物技术国家重点实验室刘巍峰教授团队在Engineering Microbiology发表了题为“Research Advances on the Consolidated Bioprocessing of Lignocellulosic Biomass”的综述论文，对基于CBP技术的木质纤维素生物转化研究进展进行了系统的综述。
基于CBP技术的木质纤维素生物炼制
木质纤维素生物质是地球上一类极其丰富的可再生资源，全球每年超过1450亿吨。相较于粮食类生物质资源，木质纤维素生物质因储量大、成本低和不与人口争粮等优点，具有转化为生物乙醇、生物柴油等生物燃料和高附加值化学品的巨大潜力。然而，目前只有3 %的木质纤维素可以被有效利用，木质纤维素生物质的合理高效利用策略有待进一步研究。经典的木质纤维素生物炼制过程可以简单地分为三段(图1)，包括木质纤维素生物质原料预处理、木质纤维素酶解糖化及发酵合成生物能源和生物基产品。其中预处理工艺复杂、纤维素酶使用成本高、野生或选育菌株生产性能不足等问题严重制约了生物炼制产业化发展。CBP技术把糖平台和发酵合并到一个反应器中进行，不仅可以节省纤维素酶发酵成本，而且不需要单独的酶解过程，因而大大降低了木质纤维素转化的复杂性和整个生物基化学品的生产成本，是木质纤维素生物质生物炼制产业化值得探索的途径。CBP菌株必须既能降解木质纤维素原料，又能实现生物化学品的合成。现在的研究主要通过三种策略构建CBP菌株(图1)：策略一是以木质纤维素降解菌为底盘的CBP构建，在天然纤维素分解微生物中通过基因工程表达目标产物的合成途径(表1)；策略二是以生物合成菌为底盘的CBP构建，将木质纤维素水解酶引入非纤维素分解微生物中，赋予它们木质纤维素降解的能力(表2)；策略三是以微生物共培养体系的CBP构建，木质纤维素水解酶和生物基化学品的合成可以由菌群中的不同菌株分工合作完成(表3)。
图1 | 三段式木质纤维素生物炼制以及CBP技术示意图
01
木质纤维素降解菌为底盘的CBP构建
自然界中存在能够有效降解木质纤维素的微生物。木质纤维素降解细菌如热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)等，通常将纤维素酶和半纤维酶等木质纤维素降解酶组织成一个纤维素小体，而丝状真菌如里氏木霉(Trichoderma reesei)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等，可以分泌丰富的纤维素胞外水解酶系。通过途径构建和代谢改造，热纤维梭菌已经被用作CBP底盘转化木质纤维素为乙醇、异丁醇和正丁醇等化学品(表1)。已经有许多研究探索通过工程设计以里氏木霉为CBP底盘实现木质纤维素转化为乙烯、木糖醇和赤藓糖醇等产品(表1)。近年来，嗜热毁丝霉作为CBP底盘的研究进展迅速。中科院天津工业生物技术研究所田朝光团队以嗜热毁丝霉为宿主，构建了一个CBP平台，无需额外添加水解酶即可一步将未经预处理的木质纤维素转化为大宗有机酸苹果酸和琥珀酸(表1)。
表1 | 利用天然纤维素降解微生物为底盘的CBP构建
02
生物合成菌为底盘的CBP构建
以生物合成菌为底盘的CBP构建策略已经被应用在许多不同的微生物中，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。酿酒酵母具有高水平的乙醇生产能力，通过异源引入纤维素酶赋予其降解纤维素的能力是构建CBP的关键。例如Yamada等人在研究中将来自里氏木霉的内切葡聚糖酶基因(eg2)和纤维二糖水解酶基因(cbh2)、来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)和来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的纤维素糊精转运蛋白基因(cdt1)整合到酿酒酵母的基因组中，从而实现纤维素酶与纤维素糊精转运蛋白在酿酒酵母中的共表达。该共表达重组菌株实现了将磷酸膨胀纤维素直接转化成4.3 g/L乙醇，达到理论产量的37 %。
表2 | 利用非纤维素降解生物合成菌为底盘的CBP构建
03
基于微生物共培养体系的CBP构建
在自然界中，复杂木质纤维素生物质的有效降解是通过众多细菌、真菌以及其他生物共同完成的。研究人员受此启发也开始关注到混菌CBP体系的研究(表3)。单一微生物菌株中木质纤维素水解酶和生物基产品合成代谢途径的表达都会增加其代谢负荷。与之不同，在微生物共培养体系中，木质纤维素水解酶和生物基化学品的合成可以由菌群中的不同菌株分工完成，因此可以通过功能特化减轻细胞代谢负担。在混菌的CBP体系中，木质纤维素被上游菌株降解，然后由下游菌株转化为生物基化学品，特别是可发酵糖的快速消耗可以缓解底物抑制，从而促进上游菌株对木质纤维素的水解。例如，在由纤维素降解真菌里氏木霉和富马酸生产菌株戴尔根霉(Rhizopus delemar)组成的真菌混菌体系，木质纤维素生物质的水解和有机酸生产过程同时发生。木质纤维素生物质被里氏木霉产生的纤维素酶水解后释放出的糖立即由同一生物反应器中的戴尔根霉转化为有机酸，最终可利用40 g/L的微晶纤维素合成6.87 g/L的富马酸。
表3 | 基于微生物共培养体系的CBP构建
展望
CBP技术在木质纤维素生物质的绿色转化利用方面展现出了巨大的潜力。在基于单个微生物的CBP体系方面，阐明CBP底盘中纤维素酶的表达、内源代谢途径和生物基化学品合成的协同适配机制，协调纤维素酶和产物合成途径的表达，有望进一步提高CBP菌株转化木质纤维素合成生物基化学品的能力。在共培养体系的CBP构建方面，系统中细胞之间的特定分工对于高效的木质纤维素生物质降解和转化至为关键。探究如何建立应用于工业制造的合成微生物群落将是未来一个重要的研究方向，必须深入了解酶、代谢途径和微生物之间的相互作用，以建立一个合成能力强且稳定的混菌体系。近年来崔球研究团队提出了基于纤维小体全菌催化剂的木质纤维素整合生物糖化(Consolidated bio-saccharification，CBS)策略，该策略是将酶的生产与水解步骤进行整合，但是将下游发酵步骤进行一定程度上的分立，创造出了更显著的产品出口灵活性。此外，人工智能(Artificial intelligence，AI)将在通过酶工程提高降解酶的催化效率、降解酶系的组成优化、降解酶的表达和分泌以及菌株的代谢工程等方面，全链条地促进基于CBP的木质纤维素绿色转化应用。
作者 | 李仲烨
编辑 | 孙昊
审核 | 王明钰 卞小莹 房博
（本刊免收开放获取的出版费用，欢迎各位学者关注、投稿！）
