手性芳香族邻氨基醇是多种药物与活性天然产物合成的骨架化合物，在氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素、屈西多巴、伊利格鲁司他、维贝隆等药物合成中具有重要价值(图1A)。氟苯尼考是应用广泛的兽用氯霉素类抗菌药，年产量超过4000吨。(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯(D-乙酯)及其类似物(cis-(2S,3R)-2a)作为氟苯尼考合成中的关键前体，含有相邻的双手性中心，合成难度大。目前，国内外工业生产D-乙酯主要采用羟醛缩合和L-(+)-酒石酸拆分的方法，该路线存在以下挑战：1) 反应使用大量硫酸铜做催化剂，导致含铜氨废水和硫化铜固废的产生，环保压力严峻；2) 传统拆分方法收率低，理论转化率最大仅为50%；3) 手性拆分剂价格昂贵，需额外工艺进行回收套用。而采用羰基还原酶(carbonyl reductase, CR)动态还原动力学拆分对甲砜基苯基-α-氨基-β-酮酯类底物(rac-1a)来不对称合成氟苯尼考关键前体的方法(图1B)，理论转化率达100%，绿色安全，对生产设备要求低，能够规避上述路线的不足。但该方法目前存在酶源少、底物加载量低和催化剂用量高等问题，难以满足工业化生产的需求。针对上述关键问题，开发新型高效的羰基还原酶对实现氟苯尼考及其它手性芳香族邻氨基醇药物中间体的绿色制备具有重要意义和应用价值。
图1 手性芳香族邻氨基醇药物及CR动态还原动力学拆分反应机理催化过程
近日，郑裕国院士团队柳志强教授课题组通过组合运用loop工程和CAST/ISM (combinatorial active-site saturation test/iterative saturation mutation)策略对微小杆菌(Exiguobacterium algae)来源的羰基还原酶(EaSDR6)进行半理性设计，获得高效突变体M6 (A138V/A190M/S193A/Y201W/N204H/V205E)，对底物1a的催化效率(kcat/Km)由野生型的0.4 mM-1提升至363.4 s-1 mM-1 ( 909倍)，且非对映选择性由59%提高至>99% (图2)。在最佳反应条件下，M6可在8 h内完成300 g L-1底物1a的催化，底物转化率>99%，时空产率达897 g L−1 d−1，且产物cis-(2S,3R)-2a的光学纯度高(>99% e.e., >99% d.e.)，底物加载量是目前文献报道的最高水平，研究表明M6具有极高的工业应用潜力(图3)。
图2 Loop工程和CAST/ISM策略半理性改造EaSDR6
升
图3 EaSDR6及M6不对称还原底物1a的反应时间进程
分子对接分析进一步揭示了M6对底物1a催化活性提高的分子机制：M6与底物1a的氢键相互作用距离(例如d(O15S-HHY150)) 较EaSDR6变短，且突变A138V、A190M、S193A、Y201W和N204H增强了与底物的疏水相互作用，这些变化有利于底物的结合和稳定(图4)。此外，过渡态结构的酶簇模型分析解释了M6对底物1a非对映选择性(即对2S构型的底物的选择性)提高的分子机制：1) 过渡态TS-M6-2S3R模型中θ(C4NADPH-H-C7s)接近160°，这有助于辅酶NADPH烟酰胺环C4原子上的活泼氢原子对底物羰基碳的亲核进攻；2) 与TS-WT-2S3R结构相比，TS-M6-2S3R具有更多的C-H····O和N-H····O的强氢键相互作用，这有利于底物(2S)-1a的结合与稳定；3) 与野生型相比，突变体M6-2S3R复合物体系的过渡态结构反应能垒更低(6.5 kcal/mol)，在热力学上更稳定，也更容易形成，因此说明突变体M6对底物(2S)-1a的选择性和催化活性也更强(图5)。
图4 EaSDR6及M6与底物1a相互作用变化的对比图
图5 不同构型酶-底物复合物过渡态结构(酶簇模型)的非共价相互作用分析
为了进一步拓展EaSDR6的底物谱，课题组制备了不同取代基结构的芳香族α-氨基-β-酮酯类底物，并借助FuncLib策略理性改造EaSDR6，获得了突变体VAF (A190V/S193A/Y201F)，随后使用12种芳香族α-氨基-β-酮酯类底物进行催化测试，该突变体对供试底物展现出了较高的立体选择性、转化率和产率(图6)。这为同类酶促反应设计，为高效生物合成手性芳香族邻氨基醇提供了新的借鉴。
图6 EaSDR6及其突变体VAF的底物谱探究
相关研究成果以“A Highly Stereoselective and Efficient Biocatalytic Synthesis of Chiral Syn-Aryl β-Hydroxy α-Amino Esters”为题，于2024年10月发表于期刊ACS Catalysis。我校柳志强教授为论文通讯作者，2021级博士研究生周涛顺为论文第一作者。
浙江工业大学生物工程学院郑裕国院士团队柳志强教授课题组已在立体选择性羰基还原酶的筛选挖掘、催化机制解析、分子改造及手性醇的高效生物合成领域取得了一系列成果，实现了他汀类药物、度洛西汀、维贝隆、氟苯尼考等手性醇医药、农药中间体的生物制造。
论文信息
Zhou T, Shen J, Li X, et al. A highly stereoselective and efficient biocatalytic synthesis of chiral syn-aryl β-hydroxy α-amino esters [J]. ACS Catalysis, 2024, 14: 15374−15385.
论文链接
https://doi.org/10.1021/acscatal.4c03273
作者介绍
周涛顺，浙江工业大学2021级硕博连读生物化工专业博士生。主要从事新型高效工业酶制剂的挖掘、改造、应用及酶催化机制等的研究。硕博期间，在ACS Catalysis、European Journal of Medicinal Chemistry、Bioorganic Chemistry、Journal of Enzyme inhibition and Medicinal Chemistry期刊发表一作论文4篇，参与申请中国发明专利8项。
柳志强，教授，博士生导师。长期从事生物制造领域基础研究和产业应用工作，在Journal of the American Chemical Society、Angewandte Chemie International Edition、ACS Catalysis等相关学科知名期刊发表论文200余篇，授权中国发明专利100余件。入选浙江省省级人才、浙江省151人才工程第一层次、江苏省双创领军人才、浙江省“钱江人才”等计划。主持或参与了多种医药健康化学品的技术创新和产业集成，实现了研究成果的产业化应用，建成了10余条工业化生产线，经济与社会效益显著。研究成果荣获中国专利优秀奖1项、省部级科学技术奖一等奖6项、浙江省专利金奖1项，两项技术成果入选“科创中国”先导技术榜。
