01
遇见/摘要
基因表达的精确调控是代谢工程与合成生物学的核心技术之一，是实现高值化合物在微生物细胞工厂中“智造”的重要手段。链霉菌能够产生大量结构各异且具备多种生物活性的次级代谢产物，是微生物天然药物的重要来源。历经多年研究，虽已开发出众多链霉菌遗传工具，但可供选择的基因诱导表达系统却屈指可数，故而开发有效的诱导表达系统依旧迫在眉睫。本文首先借助生物信息学分析，在链霉菌中发现一个可能参与鼠李糖分解代谢的基因簇。该基因簇中含有一个 LacI 家族转录调控因子 RhaR，作者通过凝胶迁移实验（EMSAs）鉴定了 RhaR 的直接标靶启动子，并通过多序列比对确定了 RhaR 结合的保守序列—rhaO 操纵子。随后，作者利用模块化设计理念，将RhaR/rhaO与组成型kasO*启动子进行组装，成功创建新型鼠李糖诱导表达系统—rhaRS1和rhaRS2。在模式链霉菌中表征结果显示，rhaRS1和rhaRS2均表现出高水平诱导表达活性，且未观测到本底表达。最终选择 rhaRS2 用于放线紫红素和紫色杆菌素的可控生产。本研究开发的诱导表达系统，极大地扩展了链霉菌诱导调控系统的工具箱，能够广泛适用于各种链霉菌。
02
遇见/内容
当前，已经开发出部分链霉菌诱导表达系统。然而，现有的诱导表达系统具有一定的局限性，例如存在高水平的渗漏表达，诱导剂不稳定、易降解或者具有毒性等问题。所以，迫切需要开发新型诱导表达系统，以便应用于链霉菌基因表达的精准调控以及合成生物学研究。
敲除鼠李糖代谢途径对天蓝色链霉菌的生长造成阻碍。首先，作者通过氨基酸同源序列比对，对鼠李糖分解代谢途径在链霉菌中的分布展开系统分析，结果在六种模式链霉菌中都发现了鼠李糖分解代谢途径的同源序列（图 1）。为探究鼠李糖对链霉菌生长的影响，作者将上述六种菌株置于基本琼脂糖培养基（MAM）中培养，结果显示鼠李糖能够作为碳源供多种链霉菌生长。为验证链霉菌中的鼠李糖代谢途径是否参与鼠李糖的利用，作者在天蓝色链霉菌 M1146 中敲除该途径，并对获得的突变株 Δrha 进行表型观察。结果表明，与野生型 M145 和 M1146 相比，在含有鼠李糖的MAM 培养基中，Δrha 无法正常生长，这显示鼠李糖的分解代谢途径参与了链霉菌对鼠李糖的利用。
确定调控因子 RhaR 的靶标基因。为确定鼠李糖代谢途径调控因子 RhaR 的靶标基因，作者针对鼠李糖分解代谢途径的所有可能启动子进行了凝胶迁移实验（图 3A）。结果显示，GST-RhaR 能够以浓度依赖的方式与 rhaG 和 rhaI 的基因间隔区域以及 rhmA 和 rhiL 的上游区域相结合（图 3B）。为探究鼠李糖对 GST-RhaR 与 DNA 结合能力的影响，作者选取了 rhaI 的启动子展开进一步研究。结果发现，鼠李糖的存在干扰了 GST-RhaR 与其靶标 DNA 序列的结合。由此得出结论，RhaR 调控因子通过结合 rhaI、rhaG、rhmA 和 rhiL 的四个启动子区域发挥调控作用，而鼠李糖能够调节该调控因子的 DNA 结合活性。
天然鼠李糖诱导系统的评估。接下来，作者以 indC 作为报告基因，对上述四个启动子的诱导情况进行评估。在R5A 固体平板上的表征结果显示，在无鼠李糖的情况下，重组菌株不产生靛蓝素；而添加鼠李糖后，则高效产生靛蓝素（图 4B）。从蓝靛蓝的产生结果来看，rhaI 的启动子表现出比其他三种启动子更为优异的性能。
人工合成模块的构建与优化。作者通过多序列比对发现了 RhaR 结合的保守序列，该序列为典型的反向重复序列，被命名为 rhaO。通过在 kasO*启动子中插入一个 rhaO 操纵子或两个 rhaO 操纵子，构建了两个鼠李糖诱导合成模块rhaRS1 和 rhaRS2。这两个诱导模块的平板表征显示，在不添加鼠李糖时，未产生靛蓝素；而添加鼠李糖时，rhaRS1 和rhaRS2 均表现出与组成型 kasO*启动子相似的高水平表达（图 4B）。为检测该诱导系统的动态范围和诱导剂敏感性，将含有 rhaRS2-indC 的重组菌株在添加了不同鼠李糖浓度（0.05～12.8mM）的 R5A 液体培养基中培养，结果发现，随着鼠李糖浓度的增加，靛蓝素的产量逐步增加，并且在培养 72 小时和 96 小时时，观察到 6.4mM 的鼠李糖诱导浓度为最佳（图 4C）。
新型鼠李糖诱导表达系统的应用。为证明鼠李糖调控系统的实用性，作者选择 rhaRS2 来控制放线紫红素（ACT）生物合成基因簇的表达。将包含 rhaRS2-act 的重组菌株分别在添加和不添加鼠李糖的 R5MS 琼脂培养基上培养（图5A），发现仅在添加鼠李糖的平板上观察到 ACT 的产生。作者进一步将该调控系统用于 CRISPRi，通过控制 dCas9 的表达，实现对靶标基因表达的动态调控（图 5B）。未添加鼠李糖时，重组菌株可正常产生 ACT；而当添加鼠李糖后，重组菌株则丧失了产生 ACT 的能力。为拓展 rhaRS2 的应用范围，作者将该系统用于驱动紫色杆菌素（vio）生物合成基因簇的表达。将由 rhaRS2-vio 驱动的基因簇导入小白链霉菌 J1074 中，所得重组菌株在添加不同鼠李糖浓度的 R5A 琼脂平板上进行培养（图 6A）。结果显示，在低浓度鼠李糖培养基中，紫色杆菌素的表达水平较强，但当鼠李糖浓度大于0.25 mM 时，紫色杆菌素的产生受到抑制。在液体发酵中也发现了这一现象（图 6B）。当鼠李糖浓度为 0.4mM 时，紫色杆菌素的产量达到最大值，而随着鼠李糖浓度的增加，紫色杆菌素的产量逐渐减少。
综上所述，本研究采用模块化的设计策略，成功创建了新型鼠李糖诱导调控系统，极大地丰富了链霉菌诱导表达系统的工具包，能够广泛应用于链霉菌基因表达调控以及重要次级代谢产物的生产。
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遇见/致谢
感谢牛国清老师课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
1. 西南大学牛国清组ME | 应用组合代谢工程策略大幅提高天然除草剂莎斯托明的产量
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3. Nat Commun｜中科院化学所敖宇飞/北师大申林合作建立酰胺水解酶立体选择性预测模型
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
