由于O-糖基转移酶改造成C-糖基转移酶非常困难,作者采用了逆向进化策略,解析该化学选择性机理。通过选择具有混杂催化属性(既可以生成O-糖苷也可以生成C-糖苷),但C-糖基转移属性占优的糖基转移酶为出发酶,通过定向进化的方法提升C-糖基转移的活性,同时翻转成为O-糖基转移酶,对获得的两个突变体进行序列-结构-功能分析,进而解析其中的精细调控机制。
作者基于课题组前期的工作基础,选择了来自于芒果中的MiCGT,该酶是中国医学科学院药物研究所戴均贵老师课题组首次报道,具有宽泛的底物谱。考虑到模式底物的价格以及易得性,选择苯丙酮类底物1a作为模式底物,测试了其在全细胞催化下的转化效率,结果证明在该反应条件下可以明显检测到产物(图1),该模式反应适用于后续的定向进化中。
图1. 本研究中的模式反应以及全细胞催化体系液相色谱检测结果
选定模式反应后,通过对已有的丙氨酸突变文库进行重筛(ACS Catal,
图2:模式底物对接图以及改造化学选择性的进化路线
为了探寻其活性变化的机理以及两种突变体应用潜力,作者对野生型以及相关突变体进行了酶学动力学参数的考察(表1),从中可以得知,ATD(M148A/V190T/S121D)催化效率的提升主要基于kcat的提高,而QDP(E152Q/V190D/S122P)则是同时提高了底物亲和力及kcat。进化途径上相关酶的kcat表明,两个突变体都是逐步上升的状态。QDP亲和力的提升来自于最后一个突变(S122P)的加入。另外转化数(TON)测试结果表明,在30 °C下,两个突变体的TON均高于9000,远高于野生型,体现了非常好的合成应用潜力。
表1:MiCGT野生型和突变体针对1a的动力学测试结果
为了进一步解析其分子机理,成功培养解析了突变体的晶体结构,由于没有获得苷元的复合物结构,作者通过对接方式将苷元引入到活性口袋,并通过分子动力学模拟确认其合理性(图3)。在两个突变体中,底物结合方式截然不同。QDP与野生型类似,底物1a在口袋中呈“卧躺”状态,而在ATD中,1a结合方式则是“直立”状态,据此初步推断化学选择性是由底物结合模式所决定。但是其周围序列是否有保守性以及是否可以直接通过序列比对进行理性设计还需要进一步确认。
图3. 野生型以及突变体与模式底物结合模式分析
图4:C-糖基转移酶类序列保守性分析
由上可知,如果需要调整糖基转移酶的化学选择性,需要依据结构改变底物的结合模式。而建立精确的结合模式作为模板是首要条件,基于本研究中所获得两个突变体对应模式底物的结合模型,可以有效指导其它糖基转移酶的改造。为了验证该策略的可行性,作者选择了四种植物来源的糖基转移酶,包括三种O-糖基转移酶以及一种C-糖基转移酶,与MiCGT相比,其序列相似性为20%-80%。通过Alphafold2进行结构预测后,将供体和受体对接到相应活性口袋中,基于野生型本身已有活性确认结合模式,进一步与两个MiCGT的模式突变体进行比对,可以非常方便地鉴定所需改变残基。将相关残基进行突变后,重新建模和对接,确认结合模式对应具体的选择性后,即可构建突变体进行测试。作者针对其中的C-糖基转移酶FcCGT,分别设计了其C-糖基化增强的突变体,具有混杂选择性的突变体以及逆转为O-糖基转移酶的突变体,而对于其余的O-糖基转移酶,设计目的为翻转为C-糖基转移酶。设计结果与测试结果见图5,可以发现所有结果均符合预期,因此可以证明机理解析对于理性设计的精确指导意义,同时也证明了该策略的实用性。
图5. 机理解析指导理性设计
鉴于所构建的模式酶突变体展示了极高的选择性与催化效率,为了验证其实用性,对相关底物谱进行拓展。一共测试了34个底物,其中QDP对于具有两个或者两个以上酚羟基底物,均能催化生成C-糖苷,但对于单酚羟基底物的活性较低甚至没有活性,生成产物也只有O-糖苷。而ATD对几乎所有底物都显示了极好的选择性与活性(图6)。依据动力学测试结果,ATD的Km值显著大于QDP的,因此在底物特异性方面能接受更加多样的结构骨架,底物谱拓展实验验证了前面的动力学实验结果。由此可以证明,通过调节糖基转移酶的化学选择性,可以打造一个非常高效的糖基化平台,为相关糖苷类产物的生产提供非常有效的途径。
图6:底物谱拓展
为了进一步验证上述平台的实用性,以含该突变体的大肠杆菌全细胞为催化剂对三种碳糖苷以及一种氧糖苷进行克级制备测试,最终成功实现了上述产物的高效获取(图7)。
图7:全细胞体系进行的克级制备实验
该研究由定向进化入手,解析选择性机理,进一步依据机理引导化学选择性理性设计。同时基于获得突变体打造了一个高效糖基化平台,不仅为糖基化合物的获取提供了相关催化剂,同时也为该类酶选择性的改造提供了一套通用的策略(图8)。
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-024-53209-1
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