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遇见·摘要
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室方诩教授团队在Carbohydrate Polymers上发表题为“One-pot synthesis of γ-cyclodextrin of high purity from non-food cellulose via an in vitro ATP-free synthetic enzymatic biosystem”的研究论文。提出了一种新的非细胞合成系统，以非粮生物质纤维素为原料，通过非三磷酸腺苷（ATP）依赖的多酶级联催化系统合成高纯度γ-CD。
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遇见·内容
环糊精(Cyclodextrins, CDs)是一种天然存在、无毒、可生物降解的环状低聚糖。它们具有亲水的外表面和疏水的中心腔，能够封装各种分子，修饰和增强包封客体分子的物理、化学和生物特性。CD主要有三种类型:α-、β-和γ-CD。与α-和β-CDs相比，γ-CD具有最大的中心腔，最高的水溶性和最有利的毒理学特征，在制药、食品和化工等行业有了广泛的应用。γ-CD的合成可以通过化学方法或酶催化来实现。然而，控制糖基化反应的α-葡萄糖立体选择性是具有挑战性的，化学合成的整个过程涉又及大量复杂的反应和过程。因此，开发一种基于简单且易得的起始原料、高原子经济性地合成γ-CD的方法具有重大研究意义。
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室方诩教授在Carbohydrate Polymers上发表了题为：“One-pot synthesis of γ-cyclodextrin of high purity from non-food cellulose via an in vitro ATP-free synthetic enzymatic biosystem”的研究论文，提出了一种新的非细胞合成系统，以非粮生物质纤维素为原料，通过非三磷酸腺苷（ATP）依赖的多酶级联催化系统合成高纯度γ-CD。该系统包含了两条新的γ-CD合成途径，即途径Ⅰ和途径Ⅱ（图1），途径Ⅰ由两个模块组成，模块Ⅰ利用纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）将再生无定形纤维素（RAC）水解为纤维二糖。模块Ⅱ中包含了三种酶，分别为纤维二糖磷酸化酶（CBP）、α-葡聚糖磷酸化酶（AGP）和环糊精葡聚糖转移酶（CGT）。1）首先CBP将纤维二糖和无机磷酸盐转化为G-1-P和葡萄糖；2）随后AGP利用G-1-P合成直链淀粉，同时释放出无机磷酸（Pi）；3)最后，CGT以直链淀粉为底物合成γ-环糊精。途径Ⅱ由三个模块组成，即模块Ⅰ-Ⅲ。途径Ⅱ中的模块Ⅰ和模块Ⅱ与途径Ⅰ中的模块Ⅰ和模块Ⅱ相同。模块Ⅲ包含多聚磷酸葡萄糖激酶（PPGK）和磷酸葡萄糖变位酶（PGM），PPGK化葡萄糖和Pi转化为葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），PGM催化G-6-P转化为G-1-P。（图1）。
图 1以纤维素为底物体多外酶级联反应合成γ-环糊精。以RAC为底物通过途径Ⅰ（A）或途径Ⅱ（B）合成γ-环糊精。
本研究利用分子排阻色谱对来自里氏木霉的纤维素酶进行纯化获得了高纯度的CBHⅠ，接着以RAC为底物，在45 ℃反应30 min获得纤维二糖。接着利用来自热纤梭菌的CBP以葡萄糖和六偏磷酸盐为底物合成了G-1-P和葡萄糖。然后测定了CBP和AGP双酶级联的活性，碘液染色实验结果显示含有CBP和AGP反应液的试管1中溶液变蓝，而在未加入酶的试管2中的溶液未观察到颜色变化，这表明在CBP和AGP双酶级联合成了淀粉（图2B）。然而，HPLC分析表明通过途径Ⅰ-条件Ⅰ，CBP、AGP和CGT三酶级联反应未合成γ-环糊精（图2A）。同时，通过途径Ⅰ-条件Ⅱ，AGP和CGT双酶级联反应合成γ-环糊精（图2A）。这些结果表明纤维二糖或葡萄糖可能抑制了γ-环糊精的合成。于是，在AGP和CGT双酶级联反应时，额外添加了纤维二糖或葡萄糖，HPLC结果表明γ-环糊精的合成被完全抑制（图2A），这表明AGP和CGT的催化活性受到了纤维二糖和葡萄糖的抑制。
图2 葡萄糖或纤维二糖对体外酶法合成γ-环糊精的影响。（A）不同反应条件下酶反应样品的HPLC分析。绿线和红线分别代表与途径Ⅰ-条件Ⅰ和途径Ⅰ-条件Ⅱ相对应的酶反应样品；蓝线和橙线分别代表添加了10 g/L葡萄糖和10 g/L纤维二糖的途径Ⅰ-条件Ⅱ的酶反应样品。γ-CD的保留时间用虚线标记。（B）CBP和AGP反应样品的碘液染色。试管1：CBP和AGP的反应样品，试管2：不含任何酶的反应样品。
为了提高纤维二糖利用的原子经济性，本研究在途径Ⅱ中引入了模块Ⅲ来将中间产物葡萄糖合成G-1-P。模块Ⅲ包含了来自Arthrobacter sp.的PPGK和来自Thermococcus kodakarensis的PGM。来自Arthrobacter sp.的PPGK在40 ℃或50 ℃下反应1小时可将葡萄糖完全转化为G-6-P，接着，来自Thermococcus kodakarensis的PGM利用G-6-P转化为G-1-P。与途径Ⅱ-条件Ⅰ相比，途径Ⅱ-条件Ⅱ的γ-环糊精产量提高了6倍（图3）。这些结果表明，在途径Ⅱ中添加模块Ⅲ减轻了葡萄糖对多酶级联反应的负调控，显著提高了纤维二糖利用的原子经济性。
图3 利用纤维二糖体外多酶级联合成γ-环糊精。（A）不同反应条件下样品的HPLC分析。绿线、蓝线和红线分别代表与途径Ⅰ-条件Ⅰ、途径Ⅱ-条件Ⅰ和途径Ⅱ-条件Ⅱ相对应的反应样品的色谱图。(B)通过途径Ⅰ-条件Ⅰ（3E）、途径Ⅱ-条件Ⅰ（4E）和途径Ⅱ-条件Ⅱ（5E）合成γ-环糊精的产量。
为了提高利用纤维二糖合成γ-环糊精的产率，本研究对γ-环糊精合成的反应条件进行了优化，首先探究了缓冲液对γ-环糊精产率的影响；在体外多酶级联反应中，当缓冲液改为100 mM HEPES缓冲液时，γ-环糊精的产率达到了350 g/m3·h。接着，优化了镁离子浓度、温度、六偏磷酸钠浓度、反应时间和pH等条件（图4）。在最优的条件下（途径Ⅱ-条件Ⅲ；图4），与途径Ⅱ-条件Ⅰ相比，γ-环糊精的产率达到了517 g/m3·h，纤维二糖合成γ-环糊精的转化率提高16倍（图4）。
图4 利用纤维二糖合成γ-环糊精的条件优化。
本研究尝试以纤维素为底物一锅法反应合成γ-环糊精。首先，对一锅法合成γ-环糊精的条件进行了优化，在最优的条件下反应24 h，γ-环糊精的产率为 25 g/m3·h。这是首次报道利用非细胞合成系统，以非粮纤维素为原料来合成γ-环糊精。最后，本研究建立了以纤维素为原料制备高纯度γ- CD的生产工艺，获得γ-CD纯度大于90%（图5）。
图5 体外酶法合成γ-环糊精。（A）γ-环糊精的生产工艺。纯化的γ-环糊精样品的HPLC（B）和MS（C）分析。
本研究通过非细胞合成系统，以非粮生物质纤维素为底物成功合成了高纯度γ-环糊精并建立了纤维素基γ-环糊精的生产工艺。该研究不仅提高了纤维素利用的经济性并且拓展了下一代木质纤维素生物炼制的方向。
微生物技术国家重点实验室方诩教授为文章的通讯作者，博士后牛康乐为文章第一作者。
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遇见·致谢
感谢方诩教授课题组对本号的支持，感谢文章作者牛康乐提供本文稿件支持！
文章题目：One-pot synthesis of γ-cyclodextrin of high purity from non-food cellulose via an in vitro ATP-free synthetic enzymatic biosystem
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122735
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遇见·往期
