摘要：对于工业生产重组蛋白生物制药，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞因其能够生产具有人类样翻译后修饰的高质量生物制剂而成为最广泛采用的宿主细胞系统。与随机整合不同，基因组安全港位点的靶向基因组编辑为CHO细胞系工程提供了新的视角，确保了长期培养中的生产一致性和高生物治疗表达水平。随着CRISPR-Cas系统知识的巨大进步，CRISPR-Cas技术的使用以及供体设计策略已被推向细胞系工程中的越来越多的新场景，允许科学家快速、方便、高效地修改哺乳动物基因组，例如CHO细胞系。根据策略和生产需求，感兴趣的基因也可以在单个或多个位点整合。本综述将概述CHO细胞系开发中最基本和最新的进展，例如不同的细胞系工程方法以及供体设计策略，用于将所需的构建体有针对性地整合到基因组热点中，这最终可能导致快速产品开发过程，具有一致的、提高的产品产量和质量。
1.引言
在工业生产重组治疗蛋白方面，哺乳动物细胞，特别是基于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的系统，发挥着最关键的作用。这种优势与其他表达系统如细菌、昆虫、转基因动物和植物相比，由于它们强大的蛋白质组装、折叠和适当的翻译后修饰（PTM）能力。CHO框架包括可以在悬浮中生长的特性，这些特性可以在满足工业需求的规模上发展；例如，细胞可以在无血清和化学定义的培养基中发展；以及由于它们的啮齿动物来源，传播感染的风险较小。在2018年7月底之前在美国和欧盟批准的316种不同的生物制药中，有140种（44%）是在CHO细胞中生产的。在生物制药中，单克隆抗体（mAbs）是一个重要部分，这一事实更加明显，考虑到84%（68种mAb产品中有57种在2018年7月底之前批准）是在CHO平台上生产的。
传统细胞系开发（CLD）方法依赖于转基因的随机整合（RI），然后通过繁琐的筛选程序来识别稳定和高产克隆。由于整合位点不可控，RI造成的两个主要缺点包括由于转基因插入的异质拷贝数和位置导致的高克隆变异，以及由于转基因拷贝数的丢失、染色体重排和表观遗传调控导致的生产时间克隆稳定性的降低。因此，将转基因敲入（KI）到转录活跃的基因组热点的靶向整合（TI）方法已成为一种可控和可预测的CLD方法。将转基因精确插入所谓的基因组安全港确保了长期培养中的生产一致性和生物治疗的高表达水平。这种策略还减少了克隆变异，并实现了与RI相当的生产滴度。
将感兴趣的基因（GOI）引入安全港基因组位点的第一种策略是利用转座酶和位点特异性重组酶/整合酶（SSR/SSI）。转座子是移动的DNA片段，对于将基因高效整合到宿主细胞基因组中至关重要，无需DNA序列同源性。利用复制-粘贴或切割-粘贴机制，转座子可以在DNA片段之间迁移。除了转座子，它们还可以用作基因传递系统，并以重组蛋白或表达质粒的形式部署DNA序列。睡美人转座子系统、Piggyback转座子系统和Tol2转座子系统是三个最重要的转座子。然而，它们在自然界中被分为两个基本亚组：I类，也称为逆转录转座子元素，以逆转录RNA序列的形式移动。II类，也称为DNA转座子，其中元素通过切割-粘贴过程通过DNA中间体进行动员。作为一类新型的整合非病毒载体，转座系统提高了表达水平和高产克隆的比例。尽管转座酶和SSR/SSI方法最初被提出作为靶向整合方法，但随着特异性核酸酶（SSNs）的发展，它们现在可以被视为半靶向整合方法，因为将重组酶/整合酶的识别位点整合到宿主基因组通常是基于随机整合。与SSNs相比，平台（主）细胞系（PCL或MCL）的产生是利用SSR/SSI介导的转基因整合的重要组成部分，因此在用GOI替换着陆垫（LP）之前，应该进行额外的筛选步骤，以确定具有高表达和低拷贝数的最佳克隆。这是通过测量报告蛋白的荧光强度或mAb的表达量来实现的。另一方面，与SSNs不同，由SSRs/SSRIs介导的过程不需要DNA修复途径或宿主细胞的其他辅助因子，也不涉及DNA合成或降解。此外，SSR/SSI系统通常具有相对较低的非特异性活性，并且由于其独特的识别位点，在特异性方面可能与SSNs相比具有优势。需要在CHO细胞中进行整体平行研究，以比较两个系统的特异性和效率。Phan等人对Flp重组酶和Cas9核酸酶进行了并排比较。他们建立了PCL，并通过Flp介导的盒式交换或基于Cas9的HDR介导的转基因整合来靶向LP。他们比较研究最显著的结果是两种系统在靶向GOI的多个拷贝方面的差异，Cas9介导的转基因整合优于重组酶介导的盒式交换（RMCE）。他们还提醒了围绕单引导RNA（sgRNA）/Cas9切割位点的异常重组。总之，结合SSR/SSI和SSNs的混合策略可以从两个系统中受益。利用CRISPR-Cas9工具进行LP的靶向整合，可以广泛筛选，以确定要跳过的理想创始克隆。此外，一旦PCL产生，就可以反复使用适当的重组酶/整合酶，而不需要依赖宿主细胞的修复机制的效率。
可编程核酸酶的出现，包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子效应子核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas9为靶向基因组修饰铺平了道路，如基因敲除（KO）、校正和插入。CRISPR-Cas9的高靶向效率、成本效益和设计的简单性使其成为基因操作的首选。CRISPR-Cas9已广泛用于CLD中各种基因组热点的TI转基因。靶向整合体显示出过量的滴度生产、低克隆变异和高生产稳定性，缩短了CLD筛选过程。
根据效应基因的结构和功能，CRISPR-Cas系统分为两类。I类包括I型、III型和IV型，由一个CRISPR RNA（crRNA）和由三个到六个Cas基因编码的多亚基效应复合体组成。II类包括II型、V型和VI型系统，它们由一个单一的效应核酸酶和一个crRNA组成，在某些情况下，crRNA也与CRISPR-Cas编码的小RNA（tracrRNA）杂交。基因组编辑技术是通过发展II类系统实现的，这些系统能够通过不同的机制诱导基因表达的定量和定性变化，包括转座酶介导的DNA整合、双链断裂（DSB）修复途径、碱基编辑和通过死亡Cas或VI型RNA编辑系统进行基因表达调节。表S1描述了不同CRISPR-Cas系统的详细属性，包括它们的功能、特征蛋白、效应物、邻近原间隔基序（PAM）序列、作用机制和切割产物。
在I型系统中，当存在PAM序列时，Cas3核酸酶由crRNA引导至目标序列，并通过切割非互补链产生单链断裂（SSB）。在II型系统中，设计为CRISPR-Cas9基因组编辑工具，使用富G的PAM序列，sgRNA引导的Cas9通过切割目标和非目标链产生双链断裂（DSB），导致产生平末端切口。不同的Cas9核酸酶同源物已被表征并重新用作基因编辑器，它们通过整体大小和PAM特异性相互区分。第一个且最被广泛表征的版本是S. pyogenes Cas9（SpCas9），它是一个大型核酸酶（1368个氨基酸），与其它同源物相比，具有相对宽松的PAM序列（5'-NGG-3'），这意味着它可以与更多的基因组位点相互作用，这在需要在导向RNA（gRNA）设计中具有更多灵活性时非常有用。S. aureus（SaCas9）和C. jejuni（CjCas9）的Cas9是两个紧凑的核酸酶，能够被包装在腺相关病毒（AAVs）中，并用于难以转染的细胞系。工程化Cas9核酸酶包括高保真度SpCas9（SpCas9-HF1，eSpCas9-1.1）、具有放松PAM的SpCas9（SpCas9-NG）、SpCas9切口酶（Cas9n）和无核酸酶活性的SpCas9（dCas9）。表S2描述了最常见的自然发生和工程化CRISPR核酸酶的特征，以及它们与SpCas9相比的优缺点。在III型系统中，这是一个不依赖PAM的系统，sgRNA引导的Cas10（Csm）蛋白在每六个核苷酸处对非目标链产生SSB，导致形成短的核酸片段。III型被细分为四个类别（A-D），IIIA型针对mRNA，IIIB型针对DNA。IIIC和IIID型的目标仍然未知。IV型在DNA和RNA上的作用原理尚不清楚。在V型中，也使用PAM序列，Cas12a（Cpf1）效应蛋白由crRNA引导，切割目标和非目标链，导致产生粘性末端切口。VI型CRISPR-Cas系统，被细分为四个亚型（A-D），也由单一的效应核酸酶Cas13（以前称为C2c2）组成。Cas13蛋白与crRNA组装形成RNA引导的RNA靶向复合体。Cas13核酸酶包含两种不同的核糖核酸酶活性，一种用于前crRNA处理，另一种用于顺式或反式RNA目标切割。在VI型中，观察到Cas13对3'端原间隔序列旁的第一个核苷酸的某些核苷酸有严格的偏好，例如A、U或C（H），而不是Lsh-Cas13a的G。这种被称为“原间隔序列侧翼序列”（PFS）而不是PAM的偏好，也已在其他Cas13酶中报道。
在这篇综述中，讨论了CRISPR介导的CHO细胞工程方法，以及不同的CRISPR供体设计策略，用于将所需的构建体TI到CHO基因组热点中。
2. CRISPR-Cas9介导的基因KO用于细胞系工程
对大量生物制剂的需求不断增长，需要不断优化和开发CHO细胞系中的生产系统。因此，研究人员正在寻找更好的选择，以增加体积容量，同时保持产品质量。这些举措包括1.基因的过表达2.非编码RNA介导的基因沉默3.基因KO。这些方法中的每一种都可以针对糖基化基因、细胞代谢、抗凋亡/促凋亡途径、细胞生产力、细胞周期检查点激酶等等。在上述提到的所有工程方法中，这篇综述在KO工程部分的主要关注点是CRISPR介导的，这些方法几乎全部基于基因KO研究。我们根据这一研究领域中的所有论文（代谢工程、信号通路工程、糖工程、表观遗传工程、酶工程、HCPs的减少和抗凋亡工程）将KO部分的文章分成更详细的类别，并进行了讨论。
2.1. 代谢工程
在连续批培养中，CHO细胞消耗大量资源，包括葡萄糖和氨基酸。然而，许多资源被转化为代谢副产物，其中一些阻碍了细胞增殖。乳酸和氨已知是限制细胞生长和生产力的主要副产物，并且在超量时会影响糖基化模式。过去，人们采用了替代的培养方法、培养基设计和代谢工程来降低乳酸的产生。
为了减少如乳酸和铵等抑制生长的代谢副产物的释放，Ley等人利用中断CHO细胞中几种氨基酸分解途径的生理效应。利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，他们操纵了七个不同氨基酸分解途径中的九个基因，包括Aass、Afmid、Ddc、Gad1、Gad2、Hpd、LOC100759874、Prodh和Prodh2。在不同条件下，破坏单个氨基酸分解基因降低了特定的乳酸和铵分泌，同时增加了特定的生长速率和活细胞密度的积分。Hpd和Gad2的破坏特别有趣，因为它们显示出不变的氨基酸摄取速率，同时具有更高的生长速率（高达19%）、更高的活细胞密度积分（高达50%）、更低的特定铵产生量（高达26%），以及乳酸产生量的减少（较少程度，高达22%）。
氨基酸分解的副产物或中间体，特别是与支链氨基酸（BCAAs）相关的那些，构成了大量抑制性代谢物。在CHO细胞中，编码催化BCAA降解的第一步的酶的支链氨基酸转氨酶1（BCAT1）通过CRISPR-Cas9被敲除。在连续批培养中，这种基因的CRISPR-Cas9介导的KO完全消除了来自BCAA分解途径的抑制性副产物的产生，如异戊酸盐、异丁酸盐和2-甲基丁酸盐，从而导致细胞生长和生产力显著增强。
2.2.信号通路工程
通过表达BMP信号转导的关键元素的CHO细胞系（CHO-BMP-4）生产重组人骨形态发生蛋白-4（rhBMP-4）。这种细胞系经历了自分泌BMP-4信号。在Kim和Lee的研究中，化学抑制剂LDN-193189显著提高了rhBMP-4的mRNA表达水平，通过抑制CHO-BMP-4细胞中的自分泌BMP信号。使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了DG44细胞中的BMP受体、BMPRIA或BMPRII基因，以产生不受BMP信号影响的宿主细胞。使用三种不同的KO宿主细胞系和DG44野生型（WT）细胞系创建了产生rhBMP-4的rCHO细胞克隆。在批培养和连续批培养中，KO衍生的克隆显示出比WT衍生的克隆显著更高的最大rhBMP-4浓度。与WT衍生的克隆相比，KO宿主驱动的克隆的平均最大rhBMP-4浓度几乎是2.4倍（p < 0.05）。
尽管强烈的mTOR活性与CHO细胞中的高生产力相关，但在实验中也表明，雷帕霉素的抑制可以通过提高活力来增加生产力。McVey等人使用CRISPR-Cas9编辑修改CHO细胞，以强制高mTORC1活性，该活性调节对营养物质和外部生长环境的代谢活动。他们破坏了PTEN，一种抑制PI3K/AKT/mTOR途径的磷酸酶，或TSC2，一种重要的mTOR抑制蛋白。在连续批条件下，只有在TSC2缺陷的细胞中mTORC1才被恒定激活。细胞体积增大，它们产生更多蛋白质，它们的特定生产力增加了两倍以上。尽管峰值活细胞密度受到损害，但总体滴度与亲本克隆相比达到了一定水平。
2.3.糖工程
利用遗传工程对糖基化酶和蛋白质骨架进行改造，以在生物治疗剂中添加或去除特定的糖基化位点的技术，已经从增强CHO细胞中糖基化控制的努力中出现。在哺乳动物细胞中，由FUT8基因编码的1,6-岩藻糖基转移酶是主要的酶，通过-1,6连接将岩藻糖转移到N-糖苷的内层GlcNAc残基上。抗体Fc区域上的核心岩藻糖的存在可以通过抑制抗体依赖性细胞毒性（ADCC）来降低其体内的治疗效力。为了进一步确定FUT8在CHO细胞糖基化中的作用，G. Yang, Wang等人通过CRISPR-Cas9技术创建了一个FUT8 KO CHO细胞系，并与WT CHO细胞进行了大规模糖蛋白组学的比较。FUT8的耗尽不仅影响了蛋白质核心岩藻糖基化，还影响了其他糖基化机制和蛋白质糖基化的相对丰度。Ronda等人（2014年）首次证明了CHO密码子优化的Cas9可以用来通过破坏参与O-和N-糖基化的COSMC和FUT8基因来改变CHO细胞的基因组。CHO细胞是生物制药行业中最常用的生产平台。因此，产生FUT8和COSMC KO CHO细胞系，可用于生产完全非岩藻糖基化的抗体，同时ADCC功能是预期的，是有利的。
当从抗体重链的核心N-连接糖上去除岩藻糖分子时，ADCC（抗体依赖性细胞毒性）会增加。敲除CHO宿主细胞中的FUT8基因是生产完全非岩藻糖基化抗体的一种流行且有效的方法。然而，FUT8-KO宿主的一个重大缺点是需要进行两次单独的CLD工作，以产生主要岩藻糖基化和完全非岩藻糖基化的抗体种类，以便在体外和体内进行比较研究。找到主要岩藻糖基化和FUT8-KO的克隆，具有足够的相同产品质量特征，以确保观察到的ADCC优势可以严格归因于非岩藻糖基化，是更加困难的。根据添加到细胞培养基中的岩藻糖量，Louie等人报告了使用CRISPR-Cas9技术创建和使用FX-KO CHO宿主细胞系，可以表达具有主要岩藻糖基化或完全非岩藻糖基化糖链剖面，以及其他相似产品质量属性的抗体分子。
N-乙酰神经氨酸（NGNA），一种在单克隆抗体（mAbs）上发现的唾液酸残基，并不被认为在CHO细胞中有相当数量的表达。NGNA唾液化水平可能因CMAH基因过度表达而上升。为了检验模型细胞增强的蛋白质NGNA唾液化是由CMAH蛋白引起的假设，基因组CMAH基因位点被修改以产生催化失活版本。通过基因组敲除CMAH验证的细胞系不再具有表面糖蛋白NGNA的唾液化。大多数具有类似人类糖基化的重组治疗性糖蛋白是由使用CHO细胞的哺乳动物宿主生产的。然而，CHO细胞中由胞苷酸单磷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）产生的N-乙酰神经氨酸（Neu5Gc）会刺激人类免疫系统。CRISPR-Cas9基因编辑系统被用来敲除CHO细胞中CMAH的表达。在突变的CHO细胞中表达的重组人促红细胞生成素（rEPO），并且rEPO的糖基分析显示G0F、G1F-GN（半乳糖化糖链）增加，而G0F-GN、G0、Man5（其他糖链）减少。
重组糖蛋白的体内半衰期和治疗效果都极大地受到N-糖苷中发现的末端单糖唾液酸的影响。在连续批培养模式下生产重组人促红细胞生成素（rhEPO）的一个重大障碍被认为是由于细胞外唾液酸酶的积累，导致rCHO细胞培养中rhEPO的唾液化水平低。为了克服这个障碍，Ha等人最初使用CRISPR-Cas9系统敲除了三个唾液酸酶基因（Neu1、2和3）。与WT细胞相比，唾液酸酶KO克隆在连续批培养中保持了唾液酸含量和四唾液酸化rhEPO的比例，而没有对细胞生长和rhEPO合成产生负面影响。在唾液酸酶KO克隆（5X KO克隆）中，额外敲除促凋亡基因BAK和BAX可以增强rhEPO合成，而不影响唾液化。5X KO克隆在连续批培养的第10天比WT细胞多三倍的唾液酸和1.4倍的rhEPO。此外，在连续批培养的第10天，5X KO克隆的四唾液酸化rhEPO水平为42.2%-44.3%，而WT细胞仅为2.2%。
Prabhu等人表明，改变重组IgG的糖型剖面是可能的。在表达重组IgG的CHO细胞中，他们使用CRISPR-Cas9工程化了核苷酸糖合成途径，以组合控制半乳糖化和岩藻糖化。当酶UDP-半乳糖4'-表异构酶（Gale）和GDP-L-岩藻糖合酶（FX）被敲除时，UDP-Gal和GDP-Fuc的合成被抑制。在双KO细胞系中，半乳糖化和岩藻糖化完全依赖于挽救途径，允许通过管理细胞外半乳糖和岩藻糖的可用性来调节UDP-Gal和GDP-Fuc的产生和细胞内核苷酸糖的可用性。半乳糖化和岩藻糖化水平可以同时独立控制，只需改变细胞外半乳糖和/或岩藻糖的可用性。这种修改的CHO宿主平台可以促进快速合成不同糖工程蛋白，以评估生物活性，并实现特定糖型的生产。
通过结合CRISPR干扰（CRISPRi）介导的糖酶敲低和随后的基于凝集素的FACS介导的选择（lectin-FACS），K. Glinšek在CHO细胞系糖工程中调查了一种新策略。他们检验了CRISPRi改变FUT8基因表达的潜力。在这个探索性研究中，为了改变CHO细胞内源基因表达，转录抑制域KRAB被融合到催化失活的Cas9（KRAB-dCas9）上。通过将CRISPRi技术与凝集素-FACS分选结合，内源基因参与岩藻糖化被下调，结果，产生低水平岩藻糖化的CHO细胞进一步富集。
使用死Cas9（dCas9）的CRISPRa用于增加内源基因转录，扩展了CRISPR工程工具箱。Karottki等人选择了Mgat3和St6gal1，这两种沉默的糖基转移酶在CHO细胞中不表达，但它们的表达将允许生产更类似人类的糖链结构。他们能够触发并增强Mgat3和St6gal1的转录，并通过识别适当产生的糖链结构在功能水平上得到验证。因此，根据这项研究，CRISPRa可以修改CHO细胞以获得特定表型。
2.4.表观遗传工程
基因拷贝数的逐渐丢失导致转录沉默，因此转录本减少，可能是转基因表达水平下降的原因之一。使用CRISPR-Cas9破坏编码DNA甲基转移酶的Dnmt3a基因，可以增加CMV启动子下转基因表达的稳定性，持续60次传代以上。Dnmt3a缺陷细胞显示出显著更高的转基因表达以及更低的启动子和全基因组DNA甲基化率。
此外，研究人员在CHO细胞中部署靶向表观遗传编辑工具，作为一种替代工程技术，在不影响基因组序列的情况下开关基因。例如，Marx等人使用dCas9激活当前沉默的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）基因，通过将Ten-Eleven Translocation甲基胞嘧啶双加氧酶1（TET1）的催化域（CD）靶向其甲基化启动子。在80多天的时间里，超过60%的转染细胞实现了稳定的上调。激活和对照培养物之间在生长或重组蛋白生产方面没有差异。
CHO细胞表达系统开发最常见的障碍之一是连续培养中重组蛋白表达的不稳定性。人们认为，由Dnmt3a、Dnmt3b和维持DNA甲基化的酶Dnmt1介导的DNA甲基化在CHO细胞中转基因表达的不稳定性中起着关键作用。已经发现，基因表达的调控与Dnmt3b介导的表观遗传修饰更强烈地相关。因此，在Feng等人的研究中，使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除了Dnmt3b基因，以创建Dnmt3b基因缺陷的CHO细胞。根据发现，与正常转染的CHO细胞相比，Dnmt3b KO CHO细胞在30次传代以上的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的长期稳定性增加了。此外，他们发现转基因Dnmt3b KO CHO细胞表达的重组人纤维连接蛋白（VN）和单克隆抗体至少比正常CHO细胞产生的多1.6倍。
2.5.酶工程
细胞生产力直接影响生产成本。为了找到影响分泌重组蛋白产生的新基因靶标，没有大规模的CHO特异性功能筛选可用。在这里，Lin等人开展了大规模的、CHO细胞特异性的小干扰RNA（siRNA）筛选，以寻找一致增加抗体产生的基因。在重组CHO细胞系中，发现了四个基因（Cyp1a2、Atp5s、Dgki和P3h2），并随后选择了CRISPR-Cas9 KO评估。Cyp1a2、Atp5s或Dgki的单一敲除使特定抗体的生产力增加了90%以上，但P3h2没有。总体而言，Cyp1a2的删除在抗体生产中显示出显著的改善，对细胞增殖的影响最小。
外源基因的随机整合需要多轮筛选和选择，可能导致位置效应和基因沉默，使得生成稳定、高产的细胞系变得具有挑战性。特异性整合（SSI）方法可能能够解决RI的问题，但其适用性受到其极低效率的限制。最近，通过抑制DNA连接酶IV（LIG4）活性，提高了额外哺乳动物细胞类型中SSI效率，这对于NHEJ修复系统至关重要。然而，这种策略尚未在CHO细胞中测试。在本文中，Wang等人使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑从CHO细胞中移除LIG4基因。值得注意的是，在ROSA26位点的精确控制下，LIG4-CHO细胞中SSI效率显著提高了9.2倍，而RI效率很可能由CHO中的NHEJ介导，被LIG4 KO阻碍。此外，CHO细胞的增殖不受LIG4消融的影响。
无血清介质中CHO细胞的悬浮培养已适应工业合成治疗蛋白。为了快速工程化CHO细胞以适应悬浮培养，N. Lee等人使用特定链的RNA-Seq发现基于它们在无血清介质中随时间变化的表达模式差异的基因。根据适应轨迹，他们发现了显著下调的基因，并随后使用基因组编辑技术确认它们的效果。Igfbp4和AqpI基因的功能删除加速了CHO-K1细胞的悬浮适应，根据基于生长的筛选和靶向扩增子测序。使用无DNA的RNA引导的Cas9核酸酶技术和特定链的转录组测序，更容易合理设计CHO细胞基因组，以有效生产高质量的治疗蛋白。
张等人建立了基于双缺陷的CHO-K1的新选择方法。他们使用CRISPR-Cas9敲除了编码催化嘧啶和嘌呤合成最后两个步骤的双功能酶（尿苷酸合酶和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶/IMP环水解酶（ATIC））的基因。这些双缺陷细胞的生存需要嘌呤和嘧啶来源的供应或编码这两种酶的开放阅读框的转染和整合。他们能够使用这些双缺陷细胞之一（UA 10）选择稳定的转染体，包含抗Her2单克隆抗体曲妥珠单抗和重组肿瘤坏死因子受体融合蛋白依那西普的重链和轻链。这些重组蛋白在转染体克隆中以稳定的方式大量产生。在另一个实验中，张等人在CHO-K1细胞中开发的多缺陷型CHO8A中删除了嘌呤/嘧啶生物合成途径中的八个酶阶段。通过转染补体DNA基因为这八个缺失的功能，恢复了原养性。后者是通过同时使用八个载体来完成的，每个载体都携带一个货物蛋白的基因和一个八个救援基因中的一个。从筛选中仅十个存活的菌落中，发现分泌单克隆抗体的高产生产者，每细胞每天高达84皮克。
细胞培养生产过程中存在的内源性羧肽酶被认为负责治疗性单克隆抗体中常见的C末端赖氨酸水平的异质性。本研究使用用于生产治疗性抗体的CHOK1宿主和每个宿主产生的表达抗体的细胞系，通过qRT-PCR分析检测了五种羧肽酶CpD、CpM、CpN、CpB和CpE的表达。根据本文，CpD显示出最高水平的mRNA表达。通过RNAi（RNA干扰）技术降低CpD mRNA水平时，C末端赖氨酸水平增加。最重要的是，质谱分析显示，使用CRISPR技术敲除CpD表达时，C末端赖氨酸切割在CpD KO细胞中被完全消除，证明CpD是CHO细胞中唯一切割抗体重链赖氨酸的内源性羧肽酶。
Shen等人是第一批指出CRISPRi可以被利用来增加CHO细胞中重组蛋白生产的研究人员，最终为CHO细胞工程开辟了新的道路。在这个实验中，作者开发了携带功能性CRISPRi系统的载体，证明了CRISPRi介导的DHFR转录成功抑制。之后，他们产生了稳定表达DHFR、模型蛋白（EGFP）、dCas9和针对DHFR的gRNA的CHO细胞克隆。结合甲氨蝶呤（MTX）选择，CRISPRi介导的DHFR抑制对CHO细胞施加了额外的选择压力，迫使它们共同放大更多DHFR和EGFP基因的拷贝。与传统的MTX选择（高达250 nM）相比，CRISPRi方法将DHFR拷贝数提高了3倍，EGFP拷贝数提高了3.6倍，EGFP表达提高了3.8倍，而不影响细胞生长。他们还将CRISPRi方法应用于增加粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的产量，提高了2.3倍。
在CHO细胞中生产的重组HIV包膜蛋白gp120在关键表位处被丝氨酸蛋白酶蛋白水解切割。补体成分1s（C1s），补体级联反应中的丝氨酸蛋白酶，在S. W. Li等人的研究中被确定为CHO细胞中gp120蛋白水解的酶。在CHO细胞系中，CRISPR-Cas9介导的C1s蛋白酶的删除消除了对重组生产的gp120的蛋白水解活性。此外，C1s蛋白酶和MGAT糖基转移酶敲除细胞，允许生产未切割的gp120，具有丰富的甘露糖5糖链模式。丝氨酸蛋白酶KO细胞系被证明对重组合成的病毒蛋白没有蛋白水解活性，为生产其他易受蛋白水解的蛋白质铺平了道路。
2.6.降低HCPs
研究人员报告了通过中断几个基因并去除宿主细胞蛋白（HCPs）来建立和工程化“清洁”CHO细胞的步骤。他们证明了有针对性的基因组编辑，协调组学研究，可能导致HCP含量显著降低。研究人员开发了基于系统生物学的计算机模型，以说明去除多个HCP可以释放大量能量，然后使用蛋白质组学在多重CRISPR-Cas9破坏多达14个编码蛋白的基因之前识别目标HCP，这些蛋白在CHO收获的细胞培养液（HCCF）中丰富，难以去除（DTR）或对产品质量产生有害影响。他们观察了6个蛋白质（大粒蛋白[BGN]、半乳糖凝集素-3结合蛋白[LGALS3BP]、Nidogen-1 [NID1.1和NID1.2]、组织蛋白酶D[CTSD]）、11个蛋白质（N(4)-(β-N-乙酰葡糖胺)-L-天冬酰胺酶[Aga]、内质网驻留蛋白29[Erp29]、G蛋白偶联受体56[Gpr56]、肾小管间质性肾炎抗原样[Tinagl1]和半胱氨酸蛋白酶[Lgmn]）以及14个蛋白质（编码YEATS结构域蛋白2[Yeats2]、SPARC[Sparc]和脂蛋白脂肪酶[Lpl]的基因）的HCP含量。他们发现敲除细胞系的HCP含量分别减少了40%、60%-70%和60%-70%。根据细胞系和生长设置，还检测到增加的利妥昔单抗（Rit）产量和改善的生长特性。与6x KO Rit细胞系的mAb/HCP比率提高了7倍，11x KO后提高了2倍，导致产品纯度显著提高。在另一项研究中，Dovgan等人证明了稳定的短发夹RNAi或使用CRISPR-Cas9的单等位基因删除目标基因足以显著降低mAb产生细胞系中共纯化的HCP水平，即使适度下调（50%）难以去除的组织蛋白酶D。这足以将组织蛋白酶D酶活性降低到可忽略的水平，防止强制降解研究中的mAb片段化，并降低质谱检测的蛋白A纯化样品中组织蛋白酶D杂质水平，从而提高产品质量。
被确定为下游处理中可能保留的10个HCPs之一的是脂蛋白脂肪酶（LPL），它水解甘油三酯中的酯。由于Polysorbates和甘油三酯在结构上的相似性，LPL可能降解最终产品配方中的聚山道醇80（PS-80）和聚山道醇20（PS-20）。因此，也创建了一个缺乏LPL活性的细胞系。LPL表达被废除，由于有针对性的突变，聚山道醇降解被抑制，而不影响细胞活性。CHO-K1 LPL KOs显示LPL表达减少了95%以上，聚山道醇降解减少了41-57%，同时保持了生物制药处理所需的特性。
虽然标准下游纯化方法充分去除了大部分HCP污染物，但清除一小部分HCP仍然很困难。研究人员评估了通过敲除Anxa2和Ctsd基因来降低HCP污染风险的KO技术的可行性。使用CRISPR-Cas9方法有效地创建了Anxa2-和Ctsd-KO CHO细胞系，作者证实细胞裂解液中相关HCP的完全去除。重要的是，所有突变细胞系在培养8天后的生长和存活与WT对照相似。
2.7.抗凋亡工程
在蛋白质生产过程中由细胞应激引起的凋亡是限制CHO细胞生产力的障碍。科学家利用CRISPRi抑制CHO细胞中凋亡基因BAK、BAX和Casp3的内源性表达。除了减少凋亡外，线粒体膜完整性得到改善，半胱氨酸蛋白酶活性降低。CRISPRi还可以减少凋亡表型，并且活细胞密度（VCD）也有轻微但显著的增加。
Grav等人在CHO细胞中使用多重设置来展示CRISPR-Cas9基因组编辑的适用性和有效性，通过同时破坏作为糖工程的岩藻糖基转移酶基因FUT8以及作为促凋亡基因的BAK和BAX。与野生型CHO-S细胞相比，突变细胞系显示出更好的抗凋亡能力。与CRISPR-Cas9结合的多重编辑可以进一步加速CHO细胞中的基因组工程。与抑制凋亡一致，含有BAK和BAX基因突变的三重和双重KO细胞系观察到活力下降的延迟，导致更长的培养寿命。使用VCL和利妥昔单抗生产确定了五种细胞系的生产力。双KO和两个三重KO细胞系的利妥昔单抗生产与野生型CHO-S细胞相当，甚至对两个克隆更好。
增加的细胞密度经常导致凋亡细胞死亡。抗凋亡CHO细胞系可能提供一种减少加强生产程序中不良结果的方法。开发并评估了表达常见和双特异性抗体的BAX/BAK双KO（DKO）抗凋亡宿主。除了提高活力外，从BAX/BAK DKO宿主衍生的克隆或群体表达的治疗蛋白也允许在14天强化生产过程的最后阶段增加生产力。BAX/BAK DKO和WT细胞产生的化合物具有相同的产品质量。
MacDonald等人使用CRISPR-Cas9工程化BCL-2家族的三个众所周知的效应蛋白：BAK1、BAX和BOK的组合KO。研究结果证实了BAK1和BAX的协同抗凋亡特性，而BOK的丧失没有明显影响。细胞死亡可以通过KO的BAK1和BAX准确观察和建模，而无需特定数量化的细胞内组分，并且被延迟和延缓。BOK似乎对CHO细胞培养的表现没有影响。
另一项研究开发了一种CHO细胞系，可以在无血清培养中适应，同时稳定表达英夫利昔单抗。使用CRISPR-Cas9基因组编辑方法，破坏了凋亡途径的关键调节因子Bcl-2拮抗剂/杀手1（BAK1），并将英夫利昔单抗编码片段插入CHO染色体的BAK1位点。在基因组编辑的细胞中，血清饥饿激活对BAK1和细胞色素C（CytC）的影响被抑制，细胞维持血清饥饿诱导的线粒体膜电位丧失和凋亡的能力增强。通过连续传代，可以在基因组编辑的CHO细胞中稳定生产英夫利昔单抗。
Shen等人表明CRISPR-Cas13d通过瞬时转染有效地抑制了CHO细胞中外源基因以及参与基因扩增、凋亡、代谢和糖基化（例如GS、BAK、BAX、PDK1和FUT8）的许多内源基因的表达，效率在60%到80%之间。他们通过将完整的CRISPR-Cas13d系统与睡美人转座子系统以及最佳gRNA设计相结合，提高了敲低效率，并迅速产生了敲低80-90%的稳定细胞。他们使用这种方法大幅减少了IgG岩藻糖化，超过90%的FUT8表达。Orlova等人同时使用Cas9酶编辑CHO S细胞的四个基因（dhfr、glul、BAX和BAK1），每个基因使用一个最优的gRNA，以加快修改克隆的选择。可以使用四种gRNA在多重方法中改变CHO细胞基因组，允许敲除八个目标等位基因中的七个。
另一项最新研究报告了使用CRISPR-Cas9消除miR-744以增加CHO细胞生产力。在癌细胞中，miR-744可能具有促凋亡特性。此外，MiR-744被确定为先前高含量miRNA筛选中生产力下降的可能靶标。因此，两个sgRNA Cas9介导的DNA DSBs环绕miR-744位点并去除了基因组miR-744前体序列。与非靶向（NT）sgRNA转染的克隆对照的156 mg/L相比，miR-744 KOs在批培养期间的抗体滴度要高得多，范围在190到311 mg/L之间，表明miRNA KO对细胞系工程的前景。
大多数使用KI策略的CHO细胞工程研究都是基于将重组蛋白编码基因引入热点，而CRISPR介导的KI方法在CHO细胞工程中很少见。Wang等人使用CRISPR-Cas9通过精确编辑两个基因来增强CHO-K1细胞的异源蛋白生产能力，加强ER微环境并增强抗凋亡能力。重组CHO细胞中外源GOI的表达通常由病毒启动子驱动，对内质网（ER）施加巨大压力，任何刺激，如代谢应激引起的缺氧，都可以破坏ER蛋白质稳态，触发ER中的未折叠蛋白反应（UPR）导致细胞凋亡。为了打破重组蛋白生产的瓶颈，他们选择quiescin-sulfhydryl oxidase1（QSOX1）和抑制凋亡蛋白（IAP）；Survivin，来操纵蛋白质二硫键形成过程和细胞凋亡途径，促进ER中的蛋白质处理能力并增强CHO细胞的寿命。结果，修改的CHO-K1细胞的抗凋亡活性增加了6.40倍，生产产量提高了5.55倍。
表1概述了关于CRISPR介导的CHO基因组工程的最重要研究。据我们所知，本节中考虑的所有CRISPR/Cas9介导的KO出版物都适合上述一个类别。在未来的CLD研究中，这些方法的组合可能被用来开发细胞系，这些细胞系不仅具有提高的活力和蛋白质生产力，同时还进行适当的糖基化，同时没有任何副产物。此外，通过使用CRISPRi/a等最新技术，可以想象生成细胞系，其中所需基因的表达根据CLD的目标进行调整。
3.CHO细胞中的转录活跃位点（热点）
传统稳定的细胞系开发（CLD）程序中广泛使用了随机整合（RI）方法。然而，这种方法中，目标基因可能被整合到异染色质或染色质的不稳定区域，需要重复多轮筛选以获得具有稳定目标蛋白表达水平的可接受表达细胞系。此外，由随机整合细胞系生产的蛋白质存在相当大的序列变异度，这可能归因于选择高生产者克隆所用选择剂的诱变性。
随着基因组工程的发展，正在研究一种新的细胞系生产方法，特别是将转基因整合到宿主细胞基因组的特定位点。为了成功的转基因敲入（KI）和表达，需要一个“安全港”基因组区域或“热点”，并且识别新的功能性热点对于这种新的细胞系生成过程至关重要。此外，对于重组蛋白、药物等的大规模基因组工程，需要能够精确有效地将大量外源DNA整合到允许转基因表达的基因组位点，并且创新的特异性整合（SSI）方法如锌指核酸酶（ZFN）、TALEN、重组酶介导的盒式交换（RMCE）以及特别是CRISPR-Cas9技术的成功依赖于事先了解转基因整合的理想位点。
表1 CRISPR-Cas9在CHO细胞工程中的应用
不同的方法，如基于慢病毒的随机整合（RI）、剪切粘贴程序，以及生物信息学工具等，可以用来在CHO细胞中识别新的热点以应用于特异性整合（SSI）应用。虽然将目的基因（GOI）定向到稳定的热点区域似乎有益，但识别这些热点可能比较棘手。公开可用的稳定热点信息并不常见，很可能是因为商业价值的考虑；尽管如此，我们在表2中列出了迄今为止从不同CHO细胞类型基因组中获得的大多数已确认的热点。
4.供体设计方法
CRISPR-Cas9介导的敲入（KI）迄今为止已在细胞系开发（CLD）方法中实施，以将GOI整合到预定的基因组区域。这通常通过使用含有GOI的质粒修复模板来完成，该模板由长的同源臂（HAs）所环绕。作为CHO细胞中的一项里程碑式研究，Lee等人报道了使用基于质粒的供体实现高效基因整合到三个不同的基因组位点，该供体包含荧光报告基因和新霉素选择标记。在另一项治疗生产方法中，一个完整的抗体表达盒（贝伐单抗）被整合到CHO的热点位点，尽管与之前实验相比效率相对较低（1.35%）。另外，通过优化CRISPR-Cas9程序（例如，评估不同的sgRNAs并实现高转染效率），Pourtabatabaei等人实现了在CHO-K1细胞系中靶向1.8 kb基因盒的高整合率。荧光富集也是用来提高KI效率的另一个技巧。
表2 不同类型CHO细胞系中的转录活跃位点（热点）
现在已广泛认识到，基于质粒的整合背后的分子机制是同源定向修复（HDR），它精确执行基因整合，而不在基因-转基因边界处产生任何错误的插入和删除（indels）。然而，HDR在某些细胞中效率不高，例如CHO细胞系，HDR事件的程度很低。在不使用抗生素选择的供体中，这种低效率更加明显。这在工业目标中尤其重要，因为由于对细胞的额外代谢负担和生产成本的增加，不期望使用抗生素标记。
最近，供体线性化方法通过体外或体内切割供体外的转基因或HAs，为提高多种细胞中CRISPR-Cas9介导的KI效率铺平了道路。正如以下各节所详述的，这些类型的供体，如HITI（同源非依赖靶向插入）（图2a）和PITCh（精确整合到目标染色体）（图2b），使用末端连接（EJ）修复途径，包括非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导的末端连接（MMEJ），分别。这些途径被称为HDR的优越竞争者，它们更有效地介导TI。除此之外，某些额外的设计技术，如同源介导的末端连接（HMEJ）（图2c）和Tild，将传统的基于HDR的供体从长HAs线性化，结合了NHEJ的高效率与HDR途径的高精度。
4.1.体外线性化
通过聚合酶链反应（PCR）方法使用同源臂特异性引物或限制性酶对传统的长同源臂供体进行体外线性化，构建一个不包含任何非同源序列的供体，可以显著提高不同长度转基因的敲入（KI）效率（见图1）。最近，一种称为Tild-CRISPR（targeted integration with linearized dsDNA-CRISPR，线性双链DNA-CRISPR定向整合）的方法证明了体外切割包含0.8-6 kb转基因、两侧各有800 bp同源臂的供体载体，可以比基于HDR的供体载体在小鼠的体外/体内基因组编辑中获得更高的KI效率（高达12倍）。
有趣的是，在另一项工作中，当同源臂的大小从约500 bp减少到33 bp时，靶向绿色荧光蛋白（GFP）报告基因到HEK293细胞的不同位点的KI效率得以保持。值得注意的是，KI率取决于插入片段的大小；随着它的增加，效率可能会降低。
体外切割方法也被用于T细胞工程的测试，通过向T细胞受体（TCR）位点添加一个1.5 kb线性化DNA盒（包含300 bp同源臂）。这表明，这种类型的供体的编辑率主要是通过结合依赖同源的路径（即HDR）与高效的非同源依赖的（即NHEJ）程序来实现的。然而，由于容易出错的NHEJ路径在这种类型的供体编辑中扮演了关键角色，因此在位点-同源臂连接处可能产生随机的插入和缺失，尽管与基于NHEJ的供体相比，发生率较低，如下面进一步详述。因此，为了避免可能的移码，应当执行精确的转基因设计，特别是当转基因与内源基因融合时（即基因标记）。
与质粒供体相比，线性供体由于自由末端，在整合前更容易受到细胞核酸酶的攻击。同时，研究发现，用耐核酸酶的磷酸硫酯修饰线性供体末端可以提高ZFN介导的基因组编辑中的KI频率和插入保真度。据我们所知，这在CRISPR-Cas9系统中尚未经过测试。
图1 利用具有同源臂（HAs）特异性的引物或限制性酶的聚合酶链反应（PCR）体外切割含有长同源臂的转基因，以构建不含任何非同源序列的供体。
尽管通过将供体连接到sgRNA或Cas9内切核酸酶以增加转基因浓度到核中已被广泛认识可以提高基于CRISPR的KI效率，但这种方法主要适用于使用单链寡核苷酸（ssODNs）向基因组中插入少量核苷酸。最近，通过使用含有长同源臂的线性供体来提高大型转基因KI的系绳方法进行了评估。2018年，一组研究人员利用链霉亲和素和生物素之间的高亲和力，在小鼠中通过应用生物素化供体和链霉亲和素融合Cas9蛋白实现了更高的靶向效率（高达95%）。
4.2.体内切割供体设计策略
体内切割策略利用Cas9内切核酸酶在转基因两侧进行切割，同时在基因组目标区域提供双链断裂（DSB）。此外，供体DNA包含由sgRNA目标位点所环绕的转基因，导致DNA线性化。这一类包括三种现成可用的策略：(i) 基于微同源介导的末端连接（MMEJ）的CRISPR-Cas9介导的PITCh（CRIS-PITCh），(ii) HMEJ，和(iii) HITI系统。在HMEJ和PITCh供体设计中，sgRNA目标位点位于同源臂的外部分，而在基于HITI的设计中，sgRNA目标区域精确定位在模板之后，全部没有同源臂（图2a）。
根据最近的文章，体内线性化供体已被证明可以提高KI效率。根据Zhang等人的体内实验，线性化供体载体，即使是短至300 bp的同源臂，也相对于环状DNA显著提高了CRISPR-Cas9介导的HDR。此外，这种方法不仅提高了KI效率，还减少了对延长同源臂的需求。然而，应该强调的是，使用线性供体可能会增加NHEJ介导的插入，除了主要的KI机制。
MMEJ是替代NHEJ（aNHEJ）的一个亚型，当发生DSB时，它作为一个替代的修复途径。当HR或NHEJ不足时，这种修复机制至关重要，但它也可能在HR可用时被使用。在分子途径方面，MMEJ类似于单链退火（SSA）（图2b,c），两者都涉及退火侧翼重复序列以修复DSB。替代末端连接（Alt-EJ）或MMEJ也被称为微SSA。
Nakade等人在2014年引入了基于MMEJ介导的PITCh系统。他们将这种方法作为TALEN和CRISPR-Cas9系统中的替代基因KI策略。CRIS-PITCh系统利用MMEJ而不是HR或NHEJ，通过极短的微同源臂（20-40 bp）进行转基因KI（图2b）。这种短的微同源可能很容易被PCR或合成寡核苷酸插入到供体载体中。由于其能力，PITCh系统是最常见的KI系统之一，它可以在各种细胞和生物体中以无骨架、方向导向和非突变的方式整合大型基因盒，并且可以轻松构建独特的供体载体。因此，体内线性化的CRISPR供体首次被使用，并证明了CRIS-PITCh系统可能适用于人类和动物细胞，特别是在HR率低的细胞中进行基因KI的挑战。此外，CRISPR-Cas9中依赖MMEJ的TI作为稳健的KI方法，在体内被测试用于修复肝细胞中的Fah突变，挽救了Fah突变动物的死亡。
对于基于HMEJ的KI，需要相对长的同源臂（约800 bp）的体内线性化转基因。为了提供更好的结果，这种技术也可以与HDR、SSA和基于NHEJ的KI相结合。HMEJ最初被探索以确定非分裂细胞中HR供体切割是否可以提高目标基因整合。在培养的细胞、动物胚胎和体内组织中，CRISPR介导的HMEJ展示了相当大的KI效率。应该强调的是，同源臂长度也对KI效率有影响，800和1600 bp的同源臂比200和400 bp的同源臂展示了更好的KI效率。
在NHEJ介导的或非同源依赖的KI（即HITI）期间，DNA末端在DSB现场被酶处理，经常在转基因整合后诱导一些插入和缺失；然而，与HDR不同，HITI可以在非分裂细胞中进行，无需使用同源臂。此外，基于NHEJ的KI可能以相似的频率在各种方向（正向或反向）捕获线性化供体。
包括NU7026在内的NHEJ抑制剂已被证明可以限制HITI效率，证明这种方法是基于NHEJ修复途径的。Suzuki等人使用这种方法将GFP整合到非分裂细胞的神经元基因组中，人类胚胎干细胞，并在体内实验（活体啮齿动物和成年小鼠大脑的视觉皮层）。他们发现HITI具有可接受的KI效率。此外，CRISPR-Cas9介导的HITI和HDR介导的KI在HEK293T细胞中相互比较，用于在AAVS1位点整合大型DNA供体（6.4 kb），发现HITI在正确整合大型供体方面具有更高的效率（大约3倍增加）。
5.CRISPR-Cas9与特异性重组酶的结合（混合方法）
5.1.单盒式整合
在过去二十年中，重组酶介导的转基因整合已被用于重组细胞系开发（CLD）。在2002年的一项最早研究中，Kito等人使用Cre/loxP系统对CHO细胞系进行工程化，以获得高产细胞。这种策略需要建立一个带有重组酶靶位点（RTSs）和选择标记的平台主细胞系（MCL）。
图2 不同的体内切割方法学。(a) 同源非依赖性靶向整合（HITI）系统。(b) 基于微同源介导的末端连接（MMEJ）的精确整合到目标染色体（PITCh）。(c) 同源介导的末端连接（HMEJ），包括同源重组（HR）和单链退火（SSA）途径。在HR过程中，RAD51促进同源配对和链交换，而RAD52在SSA途径中促进互补单链DNA分子的退火。
这一类技术中更高级的技术，RMCE，可以精确替换LP为含有目的基因（GOI）的供体载体（有效载荷向量）。RMCE平台的生成最初基于LP在宿主基因组中的随机整合（RI）。Pfizer的CLD小组的Inniss等人最近提出了一种混合方法，将CRISPR-Cas9与特异性重组酶结合使用（LP的TI）进行CLD。这种混合技术后来被几个CHO社区用于多种目的。虽然整合RTS是LP设计的基本要求，但其他方法已被应用，以允许有效选择在预定位点携带LP的细胞，并在适当的RMCE下富集细胞。这些策略包括正选择，利用报告基因的细胞分选，或两者的结合，通常通过包括单纯疱疹病毒-1胸苷激酶（HSV-TK）基因的负选择，启动子陷阱和聚A陷阱或两者的结合。在接下来的部分，我们将看到采用各种LPs和供体设计的研究，这些研究采用了混合策略。图3还说明了用于开发创新LP设计的不同策略。
2017年，Inniss等人使用CRISPR-Cas9将Bxb1/attP和Flp/FRT RMCE LPs整合到CHO-S基因组的FER1L4位点，分别建立Bxb1和Flp RMCE能力的PCL。在每个RMCE系统中，LP携带TK和GFP盒，这些盒在单独的启动子下，与包含无启动子的博来霉素抗性基因和表达IgG重链（HC）和轻链（LC）的基因的传入重新靶向向量进行交换。通过在他们的LP中包含荧光标记，并且没有抗生素选择，实现了RMCE的高效富集和克隆细胞，目标整合率达到27%。在正确的RMCE情况下，预计无启动子的博来霉素抗性基因（blaR）将在EF1α启动子下表达，该启动子已位于LP的5'端之外（启动子陷阱）。RMCE后，Flp/FRT和Bxb1/attP RMCE系统的靶向整合率分别报告为67%和92%。
2018年，Grav等人采用混合（组合）方法，以减少他们比较分析中的克隆变异。为了评估不同转基因对细胞转录组的影响，他们生成了包含loxP位点的同源CHO-S细胞系，这些位点环绕着mCherry盒及其启动子和聚A信号在lox位点之外（启动子陷阱和聚A陷阱）。从这项研究中可以得出的结论是，如果不开发MCL，就不清楚转录变化是由转基因表达还是克隆变异引起的，强调了混合技术的重要应用。
2019年，Chi等人介绍了TARGATT系统，该系统利用phiC31整合酶和CRISPR-Cas9的组合进行SSI。他们使用CRISPR-Cas9将他们的LP TI到CHO-S Hipp11位点和HEK 293T细胞的ROSA26位点。TARGATT LP由一个盒组成，共表达嘌呤霉素抗性蛋白、HSV-TK和phiC31整合酶，所有这些都由PGK启动子驱动（PGK + Puro+T2A + TK + IRES + PhiC3），两侧为phiC31 attP位点。他们还在重新靶向供体载体骨架中添加了HSV-TK基因，与LP中的HSV-TK基因一起，允许使用GCV选择消除不需要的整合物。在ganciclovir（GCV）选择之前，RMCE的效率为13.1%，在CGV处理后为97.7%。
2019年，Novo Nordisk Foundation中心的Pristovsek等人结合使用CRISPR-Cas9和RMCE系统，为CHO细胞中三个新提出的安全港位点的不同表达盒设计进行系统评估，开发了一个模块化工具箱。使用CRISPR-Cas9介导的loxP包围LP的TI产生PCL，携带EF1α-mCherry盒。值得注意的是，聚（A）被放置在LP之外（聚（A）陷阱）。生成的PCL允许快速整合不同的5'近端调控元件（启动子和Kozak/翻译启动序列（TIS）），然后是GOI，评估整合位点和载体元件之间相互作用引起的效果。这项研究考虑了控制最终重组蛋白表达的四个不同层面：克隆背景（五个亲本克隆）、染色体环境（三个整合位点）、载体设计（六个5'调控元件）和重组蛋白类型（三种不同的重组蛋白）。这产生了这四个特征的270种可能组合，其中随机选择了66种。他们得出结论，稳定的基因表达既依赖于构建体，也依赖于位点。
5.2.多盒式整合
由于单个转基因副本的生产力较低，近年来多拷贝特异性整合（TI）受到了广泛关注，混合方法在这方面提供了帮助。在这方面，Gaidukov等人在他们新确定的选择位点中构建了单、双和三LP细胞系。不同的选择标记（包括抗生素抗性和报告基因）以及LP中的Bxb1/attP位点允许在LP细胞系中有效插入多达9个mAb拷贝（将三拷贝mAb有效载荷整合到三重LP细胞系中），并明确了mAb表达与拷贝数之间的线性相关性。
Genentech的Carver等人使用了一个新开发的TI宿主，该宿主包含一个带有三个不兼容的LoxP位点（L3、LoxFAS和2L）的LP热点，以评估抗体HC和LC基因剂量和配置对蛋白质生产力的影响。由于LP设计允许在同一位点同时整合两个供体质粒，他们也评估了当HC和LC都从同一质粒表达或分别在前后质粒上表达时的位置效应。此外，这种TI宿主为利用优化的链比例铺平了道路，这是有效多链格式组装的关键参数。他们表明，七链配置（HLL-HLHL）具有更高的滴度和特定生产力。
图3 各种着陆垫设计策略。(a) TARGATT着陆垫。着陆垫供体具有由PGK启动子驱动的盒式结构，共表达嘌呤霉素抗性蛋白、1型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和phiC31整合酶。该盒式结构由一对phiC31 attP位点所环绕。为了在不融合它们的情况下共表达这些蛋白，使用了一种来自蠕虫病毒2A（T2A）的核糖体跳跃序列，以及一个内部核糖体进入位点（IRES）。(b) 带有荧光标记且无抗生素选择的着陆垫。着陆垫载体包含pEF1a启动子，后跟重组酶靶位点、TK表达单元，以及SV40启动子驱动EGFP表达，后跟第二个重组酶靶位点。此着陆垫由CHO-K1基因组Fer1L4位点的1 kb同源臂所环绕。(c) 采用混合方法（启动子陷阱和聚A陷阱）的着陆垫。供体质粒包含带有loxP和lox2272序列的着陆垫，这些序列环绕mCherry基因。EF-1α启动子和BGHpA位于lox序列之外，允许在RMCE期间进行启动子和聚(A)捕获。在供体质粒上同源臂之外放置了编码短寿命绿色荧光蛋白ZsGreen1-DR的基因，以排除随机整合事件。(d) 基于聚(A)陷阱的着陆垫。LP供体质粒由mCherry和选择标记（NeoR）表达盒组成，由长5'和3'同源臂所环绕，与感兴趣位点同源，以及在同源臂之外的ZsGreen1-DR表达盒，以排除随机整合子。(e) 用于多重TI的着陆垫。带有聚(A)陷阱的着陆垫具有由EF1α启动子驱动的mCherry荧光标记，被loxP和lox2272重组位点所环绕，lox位点外有一个BGH聚(A)尾部，允许EF1α-mCherry到GOI的RMCE，后者具有不同的5'调控序列。
在Sergeeva等人的研究中，他们将一、二、四和六个拷贝的促红细胞生成素整合到一个MCL中，该MCL具有一个表达mCherry的LP，由loxP重组位点包围，BGH polyA和新霉素抗性基因位于LP之外。由于在克隆验证、转录干扰和潜在重组方面存在挑战，具有两个以上GOI拷贝的质粒的单点多拷贝TI证明是有问题的。因此，一种将供体质粒同时整合到两个不同的CHO基因组位点的双RMCE系统被认为是多拷贝TI整合的替代方法。利用这个系统，多达四个转基因拷贝成功整合到CHO基因组位点。
2021年，Xiong等人描述了CRISPR/RMCE组合的新应用。他们提供了一个新的无病毒（VF）筛选平台，并在CHO细胞中进行了确认。在他们的研究中，他们使用了一种带有bxb1 RMCE LP的CHO-S细胞系，该LP包含一个mCherry表达单元，由SV40启动子驱动的潮霉素抗性基因（hygroR），两侧为bxb1目标位点（attP和突变attP），以及5'端的EF-1α（pEF1a-attP-mCherry-HygroR-attP）。这种细胞系，称为CHO-attP-mcherry，被利用于gRNA质粒库的TI，作为基于慢病毒的方法的替代。用于RMCE的gRNA表达盒两侧为重组酶靶位点（attB和突变attB），并且在重组酶位点内放置了一个无启动子的嘌呤霉素抗性基因（PuroR），以富集正在进行准确RMCE的细胞。全基因组VF库包含75,488个独特的gRNA，针对15,028个基因。在数据噪声更少、克隆间变异更低和稳定性方面，这种技术优于基于慢病毒的方法。
2021年，Shin等人应用了与CRISPR-Cas9配对的RMCE，研究了在需要多基因表达时，不同条件下RMCE的效率，以简化CLD流程。他们使用了他们之前生成的单LP（sLP）MCL，该MCL在AAVS1位点处含有一个loxP-EF1α-mCherry-lox2272 LP，利用HEK293细胞的ROSA26位点作为第二个目标位点，开发了两种类型的双LP（dLP）MCL。同质dLP MCLs（用于整合两个相同的GOIs）具有一个loxP-EF1α-tagBFP-lox2272 LP，而异质dLP MCLs（用于整合两个不同的GOIs）在ROSA26位点处有一个attP-EF1α-tagBFP-attPmut LP。LP外也引入了潮霉素抗性基因。三种不同类型的核定位信号（NLS）序列，SV40、cMyc和核蛋白（NP），被附加到重组酶蛋白上，三种不同类型的DNA核靶向序列（DTSs），SV40、糖皮质激素响应元件（GRE）和核因子κB（NF-κB），被添加到基因表达盒的外部，以提高RMCE组分，即重组酶蛋白和供体质粒的核运输。在sLP和同质dLP中，NP N-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS最有效，当两者都使用时报告了最高效率。在异质dLP（含有Bxb1/attP LP）中，当应用NP C-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS时，RMCE效率最好，并且在存在NP C-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS时最高。
6.挑战与未来方向
迄今为止，CHO细胞株开发（CLD）中特异性整合（TI）方法的主要目标是在资源和时间上显著节省，用于CLD，从而缩短治疗蛋白的“临床时间”。有效且精确的无疤痕靶向基因整合对于未来的基于CRISPR-Cas9的CLD将非常有意义。结合RMCE与针对CHO热点的LP特异性整合已被证明可以构建一个无骨架的TI平台，这在生物制药生产方面更为可取。更重要的是，工业观点倾向于使用真实的蛋白表达数据来评估热点，避免将报告蛋白数据不精确地推断到重组蛋白上。在TI观点的初步阶段，最明显的挑战是与传统的RI技术相比，蛋白产量滴度相对较低。然而，随着更具转录活性的安全港位点的引入，以及多基因盒或多LP整合，这一挑战正逐渐被克服。在特定基因组位点增加基因拷贝数并没有与生产力形成线性关系，主要是由于转录干扰。因此，这方面的未来方向需要集中在正确的、适用的空间上，以避免转录干扰，即可能需要分散的基因组位点来充分利用过量复制品的转录优势。另一方面，目前CRISPR-Cas9系统在工业应用中最重要的障碍是知识产权（IP）问题，这个问题可能在未来几年内仍然无法解决，并且越来越复杂。这个问题可以通过探索新的基因组编辑工具或应用替代酶，包括Cas13和Cas14，或者工程化新的CRISPR酶，如比Cas9更具特异性的基础编辑器，来克服，以实现工业目的的基因编辑，如商业CHO CLD或工程（CRISPR专利分析，2021；IP研究；Ledford，2022）。在这个时代的未来发展可能还会强调靶向工程和异源基因的TI到基因组“热点”，以确保强大且高滴度的治疗蛋白生产。通过TI过度表达抗凋亡、促增殖的分子伴侣基因和参与代谢和分泌途径的基因将非常有意义。在表3中，列出了在CHO细胞株中实施CRISPR技术用于SSI的研究。此外，一些已被证明在生产力或生长速率方面有效的基于microRNA的工程方法，如miR-17、miR-19b、miR-20a、miR-1287等，可以考虑作为TI的候选基因，从单一或多重角度来看（见表S3）。长非编码RNA（lncRNAs）也被誉为新的和强大的CHO细胞工程工具，预计将产生相当大的科学影响。
表3 报道的用于CHO细胞系中与CRISPR-Cas9相关的敲入策略
1 中国仓鼠卵巢。2 环状供体质粒。3 单LP细胞系1。4 三重LP。5 单克隆抗体。6 依那西普，一种抗TNF-α融合蛋白。7 促红细胞生成素。8 生长/分化因子5。9 C1酯酶抑制剂10 Hipp11基因。11 绿色荧光蛋白。12 经G418选择后。13 每细胞每天每克。14 复合启动子。15 增强型绿色荧光蛋白。16 增强型绿色荧光蛋白。17 双重基因敲除。18 8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶。19 参与8-氧化鸟嘌呤碱基切除修复的两个关键酶。20 二氢叶酸还原酶。21 CRISPR干扰。22 粒细胞集落刺激因子。23 CRISPR干扰。24 Bcl-2同源拮抗剂/杀手。25 Bcl-2相关X蛋白。26 活细胞密度。27 基因敲入。28 次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶。29 同源重组。30 CRISPR介导的精确整合到目标染色体。31 微同源介导的末端连接。32 红色荧光蛋白。33 单链可变片段抗体（scFv）与恒定片段（Fc）的融合。34 同源非依赖性靶向整合。35 非同源末端连接。36 红色荧光蛋白。37 C1GALT1C1。38 甘露糖基（α-1,3-）-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶，以及39 乳酸脱氢酶A。40 相对特定生长速率的变化。41 传统环状供体。42 双切割供体。43 双重基因敲入。44 一种基础远红色荧光蛋白。45 DNA连接酶IV抑制剂。46 G2/M细胞周期抑制剂氯化锂。47 同源定向修复。48 α1,6-岩藻糖基转移酶。49 线性供体质粒。50 瓜氏荧光素酶（作为富含二硫键的模型蛋白）。51 表达盒（EC：EGFPHsQSOX1b-(KDEL)作为EC#1和EGFP-HsQSOX1b-(KDEL)-BIRC5作为EC#2）。52 由胰高血糖素样肽1与人类血清白蛋白组成的融合蛋白。
携带多个LPs的工程细胞株可能被视为有用的平台，用于在不同位点整合各种治疗性转基因和工程构建（蛋白质、micro-RNA或lncRNA），这些可以作为为生物制药应用量身定制的重组细胞株。基于生物信息学和系统生物学工具的广泛基因组热点的精确评估能够为提高LP携带细胞株的表达水平以及克隆稳定性结果铺平道路。
