华科大廖荣臻组JoC | 计算揭示甘氨酸自由基酶家族羟脯氨酸脱水酶HypD催化反应机制及其化学选择性起源

学术 2024-09-20 07:36 浙江

遇见·摘要

近日，华中科技大学化学与化工学院廖荣臻教授课题组在Journal of Catalysis期刊上发表研究论文，该研究采用分子动力学模拟MD以及QM/MM计算方法，揭示了甘氨酸自由基酶家族羟脯氨酸脱水酶HypD催化反应机制及其化学选择性起源。实验上发现HypD可以催化羟脯氨酸发生脱水反应，而其同源酶HplG只能催化羟脯氨酸发生开环反应。作者通过量子化学理论计算研究发现，HypD酶活性区的Asp279在催化反应中起到关键作用。Asp279直接促进自由基介导的C-H键活化并最终导致脱水反应的发生。该研究依据底物不同的质子化状态探讨了四种不同的C-H键活化方式，详细挖掘了自由基酶HypD化学选择性的起因，有助于拓展人们对生物酶通过切换底物的质子化状态来实现催化反应选择性的理解。

图1 HypD酶选择性活化底物C-H键

遇见·内容

人体肠道中的艰难梭菌可以利用反式-4-羟基-L-脯氨酸脱水酶HypD催化反式-4-羟基-L-脯氨酸（t4L-HP）发生脱水反应并转化为1-吡咯烷基-5-(S)-羧酸(P5C)。HypD被认为是治疗艰难梭菌感染所引起的疾病的理想靶点。因此，详细研究HypD的催化机制以及了解脱水反应过程中所有可能的中间体对设计控制艰难梭菌感染的潜在药物具有重要意义。实验科学家也发现了一种HypD的同源酶HplG，该酶却能催化反式-4-羟基-D-脯氨酸(t4D-HP)发生开环反应，进而生成链状的(R)-2-氨基-4-羰基-戊酸（图2）。同属于甘氨酸自由基酶家族的两种酶HypD和HplG在催化互为异构体的底物时却发生不同的化学反应。基于这一科学问题，作者通过理论计算模拟揭示了HypD催化反应机制及其化学选择性起因。

图2 两个同源酶HypD和HplG催化不同的化学反应

首先，作者研究了HypD酶催化底物t4L-HP脱水的反应机制（图3）：HypD首先利用Asp278获取底物N位点上的质子，接着Cys434作为自由基引发剂攫取底物Cδ位点的氢原子Hδ。这一步氢原子转移反应能垒低至3.7 kcal/mol。紧接着底物发生经典的自旋中心转移（Spin-Centre Shift）反应，伴随着C-O键断裂和水分子的生成。最后Cys434将获得的氢原子Hδ转移到底物Cγ位点，并产生最终产物P5C。

图3 HypD酶催化底物发生脱水反应的机理

在作者提出的脱水反应机理中，Asp278能对两性离子底物t4L-HP进行去质子化并有效降低其Cδ-Hδ键键能，从而使Cδ成为Cys434自由基攫取氢原子的优先位点(图3：TS1a vs. TS2，TS2 vs. TS2’)。Asp278还在整个反应中起着充当“质子转运站”（Proton Shuttle）的作用：它不仅能从底物t4L-HP获取一个质子，然后还将该质子转移给后续离去的羟基，最后与生成水分子以及两性离子产物P5C形成稳定的氢键相互作用。

随后，依据同源酶HplG的催化反应特点，作者研究了HypD的化学选择性，即深入研究了HypD催化天然底物t4L-HP发生异构化反应可能的机制。在作者提出的异构化反应机理中，半胱氨酸自由基Cys434首先从两性离子t4L-HP中的Cγ上夺取氢原子Hγ（图4）。随后，羟基上的质子从t4L-HP转移到相邻的去质子化的Asp278上，同时发生自旋中心转移并导致C-N键断裂，形成新的α-羰基自由基。最后，该自由基重新从Cys434上夺取氢原子，生成(S)-AKP。该反应路径的反应能垒高达22.8 kcal/mol，比上述提到的脱水反应能垒高4.8 kcal/mol，很好地解释HypD在催化反应时的化学选择性问题。

图4 HypD酶催化底物发生开环反应的机理

值得一提的是，作者还从C-H键键能、含硫自由基的亲电性、关键位点氢原子的氢负性等方面详细分析了HypD选择性活化C-H键的内在原因。当底物t4L-HP处于两性离子状态时，Cδ-Hδ键能很高，Hγ比Hδ更接近氢负离子从而更容易被亲电的硫自由基活化（图5），进而容易发生异构化反应。但是在HypD酶活性区中，Asp278能有效地使底物去质子化，从而极大地降低Cδ-Hδ键能，使Hδ更容易被硫自由基活化，从而使反应能垒更低的脱水反应能够发生。

图5 四种不同的C-H键活化方式的能垒比较

综上，作者通过QM/MM理论计算方法的明晰了两条生成不同产物的途径并对比其反应能垒，验证了实验上所观察到的化学选择性，深入揭示了HypD的结构特征与反应选择性之间的关系。目前的理论研究不仅有助于设计通过抑制HypD酶催化活性来控制人体肠道中艰难梭菌菌群的药物，还挖掘了甘氨酸自由基酶在选择性C-H键活化中的催化潜力。该工作所提出的调控质子化状态实现选择性碳氢键活化的策略不仅有助于有机合成化学界推进碳氧键、碳氮键和碳卤键活化的发展，也对开发高效、高选择性的自由基介导有机反应具有重要意义。

华中科技大学化学与化工学院廖荣臻教授、英国达斯伯里实验室吕游博士为本文共同通讯作者，本文第一作者为廖荣臻教授课题组邓文浩。该研究得到了国家自然科学基金（22273028）、华中科技大学创新研究院技术创新基金项目(2023JYCXJJ050)的资助和支持。

遇见·致谢

感谢廖荣臻教授课题组对本号的支持，感谢文章作者提供本文稿件支持！

文章题目：Computational insights into chemoselectivity of Trans-4-Hydroxy-L-Proline dehydratase HypD - ScienceDirect

全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021951724004494

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