书接上文，今天继续以北京大学肿瘤医院近期发表在Clin Transl Med（中科院1区，IF 7.9）上的文章为例，来看下作者是如何利用干实验引出课题，又是如何用湿实验逐步让结论变得solid的吧。文章标题：ABCC2 induces metabolic vulnerability and cellular ferroptosis via enhanced glutathione efflux in gastric cancer。
首先顾名思义，咱们来看下这篇文章的主要研究内容：ABCC2（主角分子）通过增强谷胱甘肽外排（分子机制）诱导胃癌代谢脆弱性和细胞铁死亡（细胞表型）。
其次咱们来看下，由标题引出的三个关键科学问题：
关键科学问题1：主角分子选择的是ABCC2，选择依据是什么？是否排除了其他候选基因？如何进行排除的？
关键科学问题2：分子机制做的是谷胱甘肽外排？为什么做这个方向？如何验证？谷胱甘肽外排与细胞表型的关联是什么？
关键科学问题3：细胞表型关注的是铁死亡，选择依据是什么？如何验证？
关键科学问题1：主角分子选择的是ABCC2，选择依据是什么？是否排除了其他候选基因？如何进行排除的？
（1）其他文章报道的情况：一般研究的结论都是ABCC2是一种耐药相关蛋白，与较差的预后相关，但是也有部分研究（作者自身的及他人的多项研究）表明，ABCC2在胃癌中的表现是与传统观点相反的。
（2）作者自身的前期研究基础：ABCC2- 24C > T (rs717620)基因型与晚期胃癌患者新辅助化疗效果和患者预后相关（相关性研究，合计纳入103个患者，使用的检测手段为SNaPShotTM，仅检测少量几个已知的SNP位点）。
编者按：延续自己的前期研究，就是主角基因挑选的最好的选择依据，且不需要排他。但是没有前期研究基础也没有关系，咱也可以从零开始挖掘数据（可以是自测数据，也可以从公共数据中挖掘），给主角基因的出场赋予逻辑性和严谨性。ABCC2- 24C > T 是指ABCC2基因的第24个核苷酸位置上存在单核苷酸多态性，正常的胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）所替换。
虽然前期研究基础可以帮忙引出主角基因，但是毕竟仅做了相关性研究，能说明的问题还是有限的，作者接下来又用一波操作进一步夯实了为啥ABCC2可以成为主角基因。
Step 1：通过对74例配对的胃癌及癌旁样本进行全外显子测序（WES测序）及80个样本的ddPCR检测，夯实了ABCC2- 24C > T 多态性与胃癌患者较好的预后有关。
编者按：虽然还是相关性研究，但是这次样本量和检测技术都升级了，证据力度进一步得到了提升。
Step 2：在1044例胃癌患者中通过免疫组化检测ABCC2的表达水平，并探究ABCC2表达水平与患者预后的关系。结果发现ABCC2表达升高的患者预后更好。并在TCGA和GSE84437数据集中也验证了上述结论。
Step 3：作者通过免疫组化和RNAseq进一步揭示了ABCC2高表达与ABCC2- 24c > T基因型之间存在显著相关性，且利用CRISPR单克隆筛选将ABCC2点突变(rs717620)引入胃癌细胞系会导致ABCC2表达显著升高。最后作者通过双荧光素酶实验，揭示了ABCC2- 24c > T基因型之所以对应较高的表达量，可能是因为点突变减弱了上游抑制因子的抑制作用。
Step 4：作者通过自己的队列及TCGA队列数据进一步揭示了ABCC2在胃癌中可能的作用机制，结果发现ABCC2高表达会显著富集氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、氧化磷酸化等相关途径。进一步在胃癌细胞系中敲减及过表达ABCC2，并观察细胞的增殖、迁移能力及对化疗药物5-FU和LOHP的敏感性，作者发现在饥饿条件下，ABCC2高表达细胞的增殖和迁移能力显著被抑制，且对5-FU和LOHP的敏感性明显更高。然而，补充氨基酸后，ABCC2的表达不影响细胞增殖、迁移以及对5-FU和LOHP的抗性。
编者按：在这一Step中，作者通过细胞实验初步探究了主角基因ABCC2的功能。比较不走寻常路的是，作者发现ABCC2高表达细胞在饥饿条件下的功能下降，可能揭示了细胞对代谢压力的敏感性更高，这可能与它们对特定代谢途径的依赖有关。再回到主角基因的功能，ABCC2是一种已知的氨基酸和谷胱甘肽转运蛋白，这一结果表明在氨基酸缺乏的环境中，ABCC2高表达细胞的氨基酸代谢受到影响，进而影响了细胞的迁移和增殖。
关键科学问题2：分子机制做的是谷胱甘肽外排？为什么做这个方向？如何验证？谷胱甘肽外排与细胞表型的关联是什么？
在初步确定主角基因ABCC2的研究意义及功能之后， 作者进一步探究了主角基因ABCC2的下游调控机制。
Step 1：通过对不同培养条件下主角基因ABCC2敲除与否的细胞系进行RNAseq测序，结果发现，在饥饿条件下，ABCC2敲除细胞中异常表达基因基因更多，其中包含较多代谢相关基因，且显著富集在氨基酸代谢和氧化应激相关通路。
编者按：用主角基因敲减与否的细胞进行RNAseq测序，属于探究or验证主角基因下游调控机制的标配了，单个样本才几百块的费用，更是凸显了这种方式的性价比~
Step 2：基于转录组初步锁定主角基因ABCC2的下游是与代谢相关之后，作者又对不同培养条件下主角基因ABCC2敲除与否的细胞进行了代谢组学检测，结果发现，ABCC2在无氨基酸培养基中会影响线粒体呼吸和TCA循环相关代谢物的水平。
Step 3：为了探究主角基因ABCC2对细胞能量代谢的影响，作者通过Seahorse XF分析仪测量ABCC2敲除细胞的糖酵解活性和氧化磷酸化率，发现ABCC2缺失细胞在饥饿条件下表现出更高的基础呼吸率和糖酵解能力。
编者按：转录组加代谢组加湿实验，一步一步的夯实了主角基因ABCC2通过干扰氨基酸代谢途径促进细胞代谢重编程。
锁定氨基酸代谢之后，需要进一步揭示的是主角基因具体影响了什么氨基酸？产生了什么样的影响？
接下来，让我们将目光继续给到主角基因的功能——ABCC2作为一种转运蛋白，能够促进谷胱甘肽（GSH）从细胞内向细胞外的排出，so，下一个故事主角（GSH）有了~
随后作者进一步证实了ABCC2是通过GSH起作用的，鉴于GSH是细胞内重要的抗氧化剂，氧化应激也是少不了的。
Step 1：TCGA数据的相关分析揭示了谷胱甘肽代谢、ROS调节和ABCC2之间的相关性。
Step 2：代谢组结果表明，在饥饿条件下，与对照相比，ABCC2敲除细胞系的总氨基酸水平显著升高，谷胱甘肽是代谢最高的底物之一，而氧化谷胱甘肽不变，导致GSH/GSSG比值增加。
Step3：通过测定细胞培养基中的GSH水平，作者发现ABCC2敲除细胞表现出明显的GSH外排阻断，这一结果支持了ABCC2在GSH外排中的作用。
Step4：鉴于GSH是细胞抗氧化系统的重要组成部分，其水平的变化会影响细胞对氧化应激的敏感性，作者测量了细胞内活性氧（ROS）水平的变化。结果发现，ABCC2敲除细胞在营养剥夺条件下可能更容易受到氧化应激的影响，导致细胞内ROS水平的进一步上升。
关键科学问题3：细胞表型关注的是铁死亡，选择依据是什么？如何验证？
谷胱甘肽外排导致细胞内氨基酸水平下降，影响了细胞的能量代谢和氧化还原状态，并增加了细胞对氧化应激的敏感性，而铁死亡作为一种由ROS诱导的细胞死亡形式，紧接着作为下一个主角出场也就顺理成章了。后面就是大家所熟悉的铁死亡了。。。。。。
写到最后
这篇文章没有涉及复杂的调控机制，没有很新很热的科研热点，但是逻辑严谨、故事层层递进，堪称推理小说的典范。btw，推理过程一定要围绕每个角色的身份特点哦~
END
