温故知新｜新生儿期发病的脊髓性肌萎缩及其基因诊断(附四例报告)
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育儿
2024-07-30 17:02
北京
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引用格式：刘晓军,郭静,王丹,等. 新生儿期发病的脊髓性肌萎缩及其基因诊断(附四例报告)[J]. 中华围产医学杂志,2007,10(06)：396-399. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2007.06.009【摘 要】
目的 总结新生儿期发病的脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)的临床特征，探讨基因诊断的方法和意义。
方法 分析4例新生儿期发病的SMA-I型患儿的临床特点和神经电生理改变，应用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析技术对其中1例患儿进行运动神经元生存基因(sunrival motor neuron，SMN)的检测。
结果 4例患儿临床均表现为肌无力、肌张力低下、特殊的蛙腿体位；神经电生理检测显示为神经源性损害，2例运动神经电位引不出；1例患儿进 行了基因检测显示SMN基因第7、8外显子纯合缺失。
结论 定性检测SMN基因第7、8外显子缺失是SMA—I型可靠的基因诊断方法。聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析结果可靠，方法 简单、快速，易于临床普及。基因诊断结合传统诊断标准不仅可大大提高sMA-I型诊断准确率，还可为产前诊断提供依据，减少患儿出生。
【关键词】肌萎缩，脊髓性，耍儿，新生；运动神经元；基因缺失
脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy， SMA)是以脊髓前角运动神经元退行性变性为特征，以进行性、对称性肌肉萎缩和无力为主要l|缶床表 现的神经肌肉障碍性疾病。根据发病年龄和病情轻重分为4型，I～Ⅲ型为儿童型，为常染色体隐性遗传病，群体发病率为1/6000～1/10 000，基因携带率为1/40～1/60[1]。SMA-I型最严重，发病率为 0.6/10 000，占一半以上。新生儿期发病属于急性型即SMA—I型，又称werdnig-Hoffman病，病情进展迅速，预后差，多因呼吸肌功能障碍引起肺部感染，90％于1岁前死于误吸或呼吸衰竭[2]。4年来， 我院新生儿科收治并明确诊断为SMA的患儿4 例，其中1例进行了基因检测，现报道如下。 1． 一般资料：4例均为男婴，发病年龄分别为生 后1 d、1 d、10 d和12 d；就诊年龄分别为28 d、5 d、 34 d和26 d。例1为择期剖宫产，其余3例均为足月阴道分娩(适于胎龄儿)，围产期情况无异常，无新生儿缺氧缺血性脑病及抽搐史。患儿父母均非近亲结婚。 2．家系调查：例1系第2胎第2产，第1胎第1产为男孩，6个月时合并肺炎死于本病。例2系第3 胎第3产，第1胎第1产为女孩，1个月时诊断 SMA，5个月时死于肺炎、充血性心力衰竭；第2胎第2产为女孩，现体健。余2例均为第1胎第1产。 4例父母表型正常，其父系、母系家族中均无同类疾病患者。 3．临床表现：除例2以四肢无力、活动差就诊外，其余3例均因呼吸道感染而就诊，追问病史均存在少动、四肢无力。查体共同存在的体征有：神志清，眼球活动自如，无智力障碍；哭声弱；双肺可闻及痰鸣音；被动仰卧位，双下肢呈蛙腿体位，双上肢伸直平放，对疼痛刺激有反应但无躲避动作；四肢肌张力低下、肌无力，下肢略重于上肢，腱反射引不出。 肌力、肌张力低表现为：围巾征肘过中线，上、下肢回弹引不出，胭角180°，不能竖颈，手握持、牵拉、支持、踏步、拥抱反射均引不出，吸吮反射较弱。例1有呛奶；例3有肌肉萎缩、哭声嘶哑、吞咽困难；例4有矛盾呼吸。 1.实验室检查：例3血清肌酸磷酸激酶(crea tine phosphokinase，CPK)1025 U/L(正常值24～195 U/L)，例4血清CPK 85U/L，余2例未检测。 2.神经电生理检查：4例均提示神经源性损害。见表1。 3.基因诊断：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)分析技术对例4及其父母运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)进行分析。盐析法提取 DNA，PCR技术分别扩增第7、8外显子，应用限制 性内切酶DraI和DdeI对扩增片段进行酶切，电泳观察结果。经DraI酶切，父母为190 bp和165 bp 各两条带，子同阳性对照为165 bp一条带；经DdeI 酶切，父母为188 bp和125 bp各两条带，子同阳性对照为125 bp一条带。提示例4SMN基因第7和 第8外显子纯合缺失，而患儿父母未发现该缺失。4例跟踪随访到2例，分别于生后6个月、10个 月死于肺炎、呼吸衰竭。 ![]()
SMA各型严重程度差别较大。国际SMA联 合会根据SMA的发病年龄及最终达到的运动能力将其分为4型[3]：(1)SMA-I型：急性型，又称 Werdnig-Hoffmann病，是最严重的一型。表现为 明显的肌萎缩和无力(“软婴”)，出生后6个月内发病，患儿不能独坐或行走，常于2岁内死亡。(2) SMA-Ⅱ型：中间型。患儿能独坐，但不能独立行走，常于生后6个月发病，可存活2年以上。(3) SMA-Ⅲ型：少年型，又称Kugelberg-Welander病。 患儿可独坐和行走，可维持正常寿命。3岁前发病 为Ⅲa型，之后发病为Ⅲb型，二者能维持行走能力的时间有明显差异。(4)SMA-Ⅳ型：成人型。通常在30岁后发病，影响较小，可拥有正常的生活期望值。 本组4例SMA患儿均在新生儿期发病，有明显肢体活动少、肌无力、双下肢蛙腿体位表现，随访到的2例生存期均未超过1岁，符合SM良I型发病特点。 以往，SMA的诊断主要依靠符合常染色体隐性遗传特征的阳性家族史，典型的临床表现，血清 CPK正常或轻度增高，肌电图示神经源性损害，肌活检符合前角运动神经元病变特点等进行综合分析确诊。但对于新生儿期发病的SMA-I型诊断有以 下不足：(1)家庭规模的缩小或以前对本病认识的不足，造成难于提供准确的家族史，本组就有2例未提供阳性家族史。(2)新生儿神经系统发育不成熟，临床表现不典型，肌萎缩不明显，或虽有肌萎缩，但易 被皮下脂肪掩盖。本研究中4例均未发现明显肌萎 缩。所以，单纯依靠症状、体征难于确诊，容易与严 重的低血糖、弛缓性瘫痪及其他神经肌肉疾病相混淆。(3)文献报道SMA-I型患儿血清CPK正常或 轻度增高，但不超过正常值的10倍[4]，而本文2例患儿的CPK检测结果显示：例1合并肺炎、充血性心力衰竭，CPK值明显升高；例4无合并症，CPK值正常。由此认为此项指标有可能受感染、缺氧等因素影响，仅可作为与肌纤维坏死变性疾病的鉴别，不能作为确诊指标[4]。(4)神经电生理检查具有损伤小、简便易行、准确性高的特点，但由于新生儿不合作及神经系统发育延迟，神经电生理易出现募集相电位，因此结果仅供参考；运动神经传导速度明显降低或引不出、潜伏期延长、肌纤维反应幅度降低等不典型表现，也是延误诊断的原因。既往就有单纯依靠神经电生理检查造成假阴性的报道[5]。本研究中就有2例患儿运动神经电位未引出。(5)肌肉活检为有创性检查，难于被患儿家属接受，本研究4例患儿家属均不同意做肌活检。而且早期肌活检，病理改变往往不典型，也是导致漏诊或误诊的原因。 1990年美国学者Brzustowicz和法国学者 Melki等将儿童型SMA基因定位于5q11.2～ q13.3。1995年，法国Lefebvre等[6]克隆了5q13．1 区域中的sMN基因。此后，虽相继有其他与SMA 发病相关基因位点被发现，但大量研究结果表明， SMN基因是SMA的致病基因。SMN基因在同一 条染色体上有两个高度同源、以反向重复序列存在的拷贝，着丝粒侧称SMN2，端粒侧称SMN1。 Wirth[7]对SMNl基因突变研究资料的统计学分析显示：96％SMA患儿存在SMNl基因突变，5％正常人群可发现SMN2纯合缺失而不导致疾病； SMN2基因转录产物缺乏第7外显子，导致其编码的全长SMN蛋白量较SMNl明显减少，而无法发挥正常功能。因此，SMNl被认为是SMA的决定基因，SMN2的拷贝数与SMA表型有关。在这2个拷贝之间仅有5个碱基的差异，其中2个位于第 7、8外显子，另3个在6、7内含子。众多学者对不同种族SMA患者的研究结果显示，90％～98％的 SMA患儿存在SMNl基因第7外显子或第7、8外显子的纯合缺失，而SMA-I型患儿缺失率更高，国内有报道SMN1第7、8外显子纯合缺失可达 100％[8]。证据表明绝大多数SMA—I型患者的发病机制是SMNl缺失伴有更少的SMN2拷贝[9]。 所以，定性检测SMN1基因第7、8外显子的缺失可 作为SMA-I型可靠的基因诊断手段，而且无需对患儿父母是否为携带者进行检测。 目前常用的基因缺失检测方法和技术有：(1) PCR-单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)技术：可将 SMNl和SMN2，区分开。但因第7外显子存在多态性，有假阳性；电泳时温度变化也可造成假阳性或假阴性结果；且实验要求高，不易临床普及。(2) PCR-RFLP：此法阳性率95％以上，具有特异性好、 灵敏度高、方法简单、诊断快速准确、结果容易判断、 无假阳性、重复性好等优点，成为目前临床最常用的基因诊断方法。但不能对SMN1的杂合缺失及携 带者状态进行分析。(3)PCR-变性高效液相色谱法 (PCR-denature high performance liquid chromatography，PCR-DHPLC)：不仅能快速有效的检出 SMNl基因的纯合缺失，还可以定量检测SMN1和 SMN2基因，并可靠检测携带者[10]。但该法需结合 DNA测序，检测仪器成本高，不适于临床推广。综上所述，对于SMA-I型患者，PCR-RFLP分析技术 是最为简单有效的基因诊断方法。该法利用错配引 物分别扩增第7、8外显子，利用SMNl和SMN2在 第7、8外显子的碱基差异，在SMN产物中引入 DraI(第7外显子)或DdeI(第8外显子)酶切位点， 使SMN2被酶切开而SMN1则无法酶切，从而判断是否存在SMNl的第7和(或)第8外显子纯合缺 失。本研究应用该法对其中1例患儿进行了基因检测，证实其存在SMN1基因纯合缺失。此外，对没有检测到缺失的基因内突变SMA-I型患儿和携带者，可根据情况应用等位基因特异性竞争PCR或实时荧光PCR法等进一步做SMNl基因定量分析或连锁分析，必要时还要进行基因测序，可大大提高诊断准确率[11]。当然，这些方法普遍存在程序复杂、 影响因素多、检测成本高及技术不够成熟等缺点，导致临床实用性不强。 目前此病尚无有效的治疗方法，SMA患儿的出生会给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担，因此应用分子诊断技术进行产前诊断，避免息儿出生， 成为防治本病的关键。产前诊断取材有：(1)孕早期 (妊娠7～9周)绒毛，提取DNA量多，但易被母体组织细胞污染，产生假阴性结果[12。。(2)孕中期：妊娠18～24周抽取胎儿脐血，但难度大、危险性高；妊娠16～20周抽取羊水细胞，相对比较安全，但培养过程中易出现污染或培养失败导致试验无法进行。 上述方法均为有创性方法，易导致流产或胎儿畸形。 (3)目前，利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行产前诊断的方法已应用于临床，为非创伤性诊断方法，孕早期即可实施。 需要指出，产前诊断应慎重。对于有SMN1基因纯合缺失先证者的家庭，患儿父母必然是SMN1 缺失基因的携带者，通过定性的方法即可进行明确产前诊断，这对绝大多数SMA-I型都适用，结合连锁分析法可排除母血污染和提高产前基因诊断的准 确率和成功率。对于先证者未行基因检测和少数无 SMN1基因同源缺失的SMA家庭，产前诊断则应进一步做SMN基因定量检测结合连锁分析，必要 时还要进行基因测序。本组例4患儿父母若再孕， 则可直接通过PCR-RFLP分析技术检测决定是否继续妊娠；而另外3例即使未发现SMN1基因纯合缺失，也不能保证出生的婴儿正常，还要应用定量方法检测有无小片断缺失或点突变的存在。 另外，应用基因诊断技术还可进行植入前诊断。 结合体外受精技术，在胚胎发育到8～10个细胞时应用显微操作，对单个细胞进行遗传学或DNA分析，将检测结果正常的胚胎细胞植入官腔使之正常发育，以帮助有过SMA患儿的家庭获得健康的后代。 总之，基因检测方法在临床的应用，为SMA的诊断提供了新方法，显著提高了sMA诊断的准确性，降低了漏诊和误诊率，并可替代肌肉活检等有创性诊断手段。同时还可用于产前及植入前诊断，有利于遗传咨询，并为将来的基因治疗提供有力的帮助。![]()
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