01
遇见/背景
含氮杂环是许多上市药物和候选药物的重要结构基团，因此挖掘并解析催化C–N键形成的氧化酶对于生物催化具有重要的意义。细胞色素P450酶具有多样的催化功能，近年来有少数P450酶被报道催化C(sp2)–N键形成（TleB，HinD，P450NB5737，AspB，NzeB/P450F5053），但目前未有催化C(sp3)–N键形成天然P450酶的报道。抗肿瘤化合物星形孢菌素（staurosporine，STA）结构中含有两个C–N糖苷键，与其活性密切相关，其中C5'-N12键推测由细胞色素P450酶基因staN（Streptomyces sp. TP-A0274）负责形成，但其体外功能和催化机制尚不清楚。近日， 相关研究成果 “Molecular basis for the P450-catalyzed sp3 C‒N glycosidic bond formation in staurosporine biosynthesis”在ACS Catalysis上发表。研究人员通过体内遗传学和体外酶学鉴定了首例催化C(sp3)–N键形成的天然P450酶，进一步的蛋白晶体学、QM/MM计算和定点突变揭示了其催化机制，与大多数已报道的自由基机制不同，该过程形成独特的两性离子中间体。这项研究为进一步酶工程改造P450酶用于含氮活性化合物开发奠定了基础。
02
遇见/内容
作者首先在海洋来源链霉菌Streptomyces sanyenesis FMA中阻断了staN的同源基因spcN，发现突变株中产生的均为C5'-N12键断开的化合物；进一步通过多种表达条件的摸索，获得了可溶性蛋白，采用体外酶学实验表明SpcN催化前体holyrine A中C5'-N12键的形成。
之前的报道推测STA中C5'-N12键的连接可能经历C5'羟基化的过程，作者进行了反应时间点实验，但未发现中间体holyrine B（holyrine A C5'羟基化化合物）的形成，表明其催化可能并非遵循该机制。为了探究其催化机制，获得SpcN与其底物holyrine A的共结晶蛋白质结构，该结构由三个单体组成，每个单体血红素附近结合了一个底物。三个底物的结合方式类似，主要由一些非极性氨基酸和少数极性氨基酸稳定，并通过丙氨酸扫描确定了这些氨基酸的功能。作者发现，底物中与血红素中心距离最近的为吲哚咔唑母核的C9和C10位，而N12位和糖环C5'与血红素中心距离均>10 Å，表明血红素中心直接对底物进行C5'–H活化是很难发生的。
进一步地，作者将SpcN蛋白与辅酶Fdx对接，并使用伞型采样获得了SpcN蛋白中底物从“distal”转变为“proximal”的构象。进一步的QM/MM计算表明，Cpd I攫取C5'–H5'氢的势垒为21.4 kcal/mol，之后生成去饱和化产物，与体内和体外实验结果不符；当CpdI先攫取C4'-OH氢的势垒为19.0 kcal/mol，之后生成羟基自由基Int1，在Int1O8自由基可攫取吲哚的氢，形成更稳定的吲哚自由基中间体Int2。随后Cpd II攫取C5'–H5'的氢，形成双自由基Int3。Int3容易发生C1'-O6'断裂，形成特殊的两性离子中间体Int4。随后Int4发生分子内亲核进攻，产生C5'–N12连接的产物。
综上所述，作者通过体内遗传学、体外酶学、蛋白晶体学结合QM/MM计算首次阐明了细胞色素P450酶催化C(sp3)–N糖苷键形成的分子机制，拓宽了对细胞色素P450酶催化功能和机制的理解，将进一步指导酶工程改造构筑含氮杂环活性化合物。
中国海洋大学医药学院肖菲博士和厦门大学2022级博士生周太平为该论文的共同第一作者，李文利教授和王斌举教授为共同通讯作者。研究工作得到了国家自然科学基金等项目的资助。
03
遇见/致谢
感谢李文利教授课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
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2. 中国海洋大学李文利组Angew | 独特的II型聚酮合酶参与肉桂酰脂生物合成
3. 中国海洋大学李文利组JACS | 细菌酰基转移酶特异性选择具有羧基末端酰基供体的分子基础
4. 张长生、王斌举组合作JACS丨氮杂蒽醌DNM的生物合成：Fe(II)/α-KG依赖型双加氧酶催化恶唑啉成环与开环的酶学机制
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
