一种新的RNA的复制和进化技术
合成生物学作为一门新兴的跨学科领域，近年来在生物技术行业中迅速崛起，其目标是通过设计和构建新的生物系统来解决人类面临的健康、环境和能源等问题。细胞工程则致力于通过改造细胞来实现特定的功能和应用，如生产药物、治疗疾病等。
在合成生物学的发展过程中，定向进化技术成为了一个重要的工具。定向进化通过模拟自然选择过程，使生物分子或细胞系统在特定条件下不断进化，以获得更优的性能。然而，现有的哺乳动物细胞定向进化方法存在一些局限性，例如宿主基因组的干扰、变异库规模小以及突变过程不可控等问题。这些问题限制了合成生物学在哺乳动物细胞中的应用和发展。
北京大学林一瀚与博士后马良发了一种名为RNA复制酶辅助连续进化（REPLACE）的新技术。该技术利用正交的RNA复制系统，实现了在哺乳动物细胞中对RNA基设备的定向进化。REPLACE技术不仅能够生成大量多样化的RNA库，还能通过化学诱导的突变来实现对RNA的可控进化。相关内容以“Orthogonal RNA replication enables directed evolution and Darwinian adaptation in mammalian cells”为题发表在《Nature Chemical Biology》上。
【主要内容】
一、关于REPLACE技术
REPLACE技术的核心优势在于其正交性和可控性。通过工程化的RNA复制系统，研究人员能够在细胞内独立于宿主基因组进行RNA的复制和进化，避免了对宿主基因的干扰。同时，利用抗病毒药物诱导的突变机制，实现了对RNA突变频率和谱系的精确调控。这种可控的突变能力，使得研究人员可以根据实验需求，灵活地调整RNA的进化方向和速度，从而高效地筛选出具有特定功能的RNA变体。
图1 通过工程化RNA病毒复制系统来实现哺乳动物细胞中的RNA复制和进化
研究人员通过优化Sindbis病毒复制子的非结构蛋白连接序列，构建了多个版本的复制RNA（repRNA），提高了其在宿主细胞中的兼容性和稳定性。优化后的repRNA-v3和repRNA-v4显著提升了BHK-21细胞的增殖能力。此外，通过限制RNA复制酶nsP4的表达，进一步增强了RNA的宿主兼容性。通过测量EGFP表达，研究人员发现限制复制酶水平能提高RNA的短期稳定性，并在一个月内保持稳定水平。
二、REPLACE技术应用
在应用层面，REPLACE技术展现出巨大的潜力。研究人员已经成功利用该技术对荧光蛋白和转录因子等生物分子进行了定向进化，优化了其性能。此外，该技术还使细胞能够适应外部环境挑战（如药物抑制）和内部基因突变挑战（如KRAS显性负突变），为疾病治疗和基因工程提供了新的思路。例如，在癌症治疗中，通过诱导肿瘤细胞的KRAS基因发生有益突变，可能实现对肿瘤细胞的精准调控和治疗。
图2 通过化学诱导和剂量依赖的方式在工程化的RNA复制系统中实现RNA的突变和进化
研究人员使用抗病毒药物（如核苷类似物）来降低RNA复制酶的保真度，从而诱导RNA突变。他们通过测序发现，无诱导剂时RNA突变率低。测试多种核苷类似物后，发现favipiravir和molnupiravir能在不影响细胞活力的情况下，以剂量依赖的方式降低EGFP荧光信号，表明其能诱导RNA突变。实验显示，这些药物显著提高RNA突变频率至每天每千碱基约1个突变，尤其是molnupiravir，能诱导出平衡的突变谱，增强所有主要突变类型的频率。
图3 利用RNA复制酶辅助的连续进化（REPLACE）技术在哺乳动物细胞中进行生物分子的定向进化
研究人员将目标蛋白的基因（如荧光蛋白和转录因子）置于复制RNA的亚基因组启动子下，通过电穿孔将这些RNA导入细胞中。为了加速突变过程，研究人员在培养基中添加了抗病毒药物molnupiravir，以诱导RNA突变。通过流式细胞分选技术，研究人员能够选择出表现出所需表型变化的细胞群体。经过多轮的突变和选择，研究人员成功地获得了具有改进功能的生物分子变体，并且优化了配体响应性转录因子VP64–PadR的配体敏感性和剂量响应行为。
图4 REPLACE技术如何使哺乳动物细胞能够适应细胞外挑战
研究人员将携带MEK1基因的复制RNA导入细胞，通过molnupiravir诱导RNA突变，使细胞暴露于MEK1抑制剂中。经过选择和进化，存活细胞中的MEK1 RNA发生突变，增强了MEK1活性或降低了对抑制剂的敏感性，从而使细胞能够在药物环境中生存
图5 REPLACE技术如何帮助细胞适应KRAS基因的显性负突变挑战
研究人员将KRASS17N显性负突变的复制RNA导入细胞，模拟基因治疗抑制KRAS活性。通过molnupiravir诱导RNA突变，细胞进化出多种KRASS17N突变，其中N17T突变能逆转显性负效应，恢复KRAS功能和细胞增殖能力。
【全文总结】
本文介绍了一种名为RNA复制酶辅助的连续进化（REPLACE）技术，通过工程化的RNA病毒复制系统在哺乳动物细胞中实现定向进化和适应性进化。该技术克服了传统方法的局限性，能够在细胞内产生大量RNA变体，并通过化学诱导的突变和选择压力实现功能优化。研究人员展示了其在生物分子进化和使细胞适应环境及基因突变挑战方面的应用潜力，为合成生物学和细胞工程提供了新的工具，推动了相关技术在疾病治疗和生物制造等领域的应用发展。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41589-024-01783-2
来源：BioMed科技
