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大家好呀，我是你们的大海哥！大海哥这个月一直在写SCI，今天终于有空给大家分享研究思路了。大家也知道近几年随着生物信息学的发展，代谢组学、网络药理学在中医药研究的重点方法，将“网络药理学”与其它实验手段结合，则是现在高端研究的大趋势！今天大海哥要给大家分享一篇结合了“网络药理学分析+动物模型+代谢组学”的文章。快拿上你的小本本一起来和大海哥学习这篇文章的研究思路吧！
本研究是南京中医药大学段金廒团队2024年1月上海交大宋宪民教授研究团队在Phytomedicine上发表的题为“Study on the underlying mechanism of Poria in intervention of arrhythmia zebrafish by integrating metabolomics and network pharmacology”的一篇文章。
1.文章采用代谢组学+网络药理学+分子对接+斑马鱼模型验证，探讨了茯苓干预心律失常斑马鱼的潜在化合物和机制。2.研究结合网络药理学和代谢组学分析来预测茯苓的潜在成分、靶点和相关信号通路，并通过PCR实验、分子对接和酶活性抑制等实验方法验证了茯苓的抗心律失常作用机制。PS：中医药相关研究的小伙伴，网络药理学是近年中医药领域发文最有力的工具之一。若再附上少量实验，轻松发文不在话下。没思路、想要了解生信数据挖掘、不知如何创新的小伙伴中找大海哥吧，大海哥能为你提供各种具有特性的优质服务，欢迎滴滴！题目:代谢组学与网络药理学结合研究茯苓干预斑马鱼心律失常的机制公众号后台回复关键词“999”即可获得原文，文献编号：241105
心律失常是一种常见的心血管疾病，涉及到心脏的节律和频率异常，其严重时可产生房颤等症危及生命。目前治疗的方法主要药物治疗、人工起搏器植入和导管消融等，但效果仍有局限。这是由于心律失常病因复杂，单靶点治疗不能完全实现心律失常的治疗。中药复方具有多靶点治疗特点，在心律失常的治疗中具有一定的优势。茯苓作为常用药，对心、脾、肺、肾经络有明显作用，具有健脾安心的功效，已用于水肿、化痰、心悸和失眠等疾病，但茯苓的抗心律失常具体机制有待研究。本研究旨在探索茯苓改善心律市场的潜在化合物和作用机制。本研究首先通过代谢组学结合网络药理学预测茯苓的潜在成分、靶点和相关的信号通路。随后进一步优化了茯苓水提取物工艺，通过基于超高效液相色谱仪-四级杆飞行时间质谱仪的代谢组学对水提取物进行成分分析。进一步使用氯化钡诱导斑马鱼心律失常模型，评估茯苓水提取物对心律失常的影响。最后，结合网络药理学+中药靶向代谢组学分析，预测茯苓可能调控的信号通路和代谢通路，并通过PCR实验、分子对接等实验验证了茯苓的抗心律失常作用机制。（PS：本研究的设计路线图，各位小伙伴可以参考哦~）。作者首通过TCMSP(传统中医药数据平台)、BATMAN-TCM（用于预测中药成分和靶蛋白之间的相互作用）和ETCM（中医药百科全书）等数据库获得了茯苓中的58种化学成分和662个潜在治疗靶点，同时还获得了905个心律失常的潜在治疗靶点。通过与心律失常的潜在靶点进行交叉分析，作者获得了38个茯苓治疗心律失常的可能靶点。并将38个靶点导入String在线平台，获得PPI网络，分析出18个核心靶点与心律失常相关（图1A-B），结果表明茯苓可能是多靶点互作来发挥抗心律失常作用。为确定与茯苓潜在爸爸点相关的信号通路。作者进一步通过GO/KEGG分析揭示了茯苓可能参与了膜电位、离子转运、钠通道复合物以及离子通道结合等分子功能的调控过程，参与调控肾素分泌、cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路等（图1C-D）。 作者通过响应面法优化了茯苓的提取工艺。结果表明，第一次提取时间（A）、第二个提取时间（B）以及固液化这三个因素之间存在相互作用，其中第一次提取时间的影响最大，其次是第二次，最后是固液比。作者根据软件预测的最佳提取过程和实际情况，确定了茯苓的最佳萃取条件为9升水、7.5小时的第一次萃取时间和1.5小时的第二次萃取时间（图2）。随后作者通过代谢组分析了茯苓提取物的成分，共鉴定出8种化合物：包括7-氧代脱氢松香酸、去氢烟酸、松香酸A、7-氧代脱氢松香酸、7-氧代脱氢松香酸、7-氧代脱氢松香酸（图3）。图3用UPLC-Q-TOF-MS法获得的茯苓总离子电流色谱图随后，作者通过使用氯化钡诱导心律失常的斑马鱼幼虫，通过测定诱导后的斑马鱼幼虫的心包面积、心率、窦静脉-球部动脉（SV-BA）距离等结果表明模型的建立成功（图4A-E）。进一步探究茯苓对心律失常的影响，通AO（吖啶橙，检测细胞凋亡）染色法评价茯苓对氯化钡诱导的心律失常斑马鱼心肌细胞凋亡的影响。结果显示，结果显示，与心律失常组相比，高、中、低剂量茯苓组的荧光强度分别下降了1.79、1.39和1.50倍，这些结果提示茯苓可干扰氯化钡诱导的心律失常的发生（图4F）。 作者使用基于超高性能液相色谱法-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）的代谢组学技术，结合多变量统计分析，收集并评估各组斑马鱼幼虫代谢组学的变化。非靶向代谢组学的PLS（偏最小二乘回归分析）分析显示，对照组和模型组之间的代谢物存在显著差异（图5A-B），表明氯化钡诱导了斑马鱼体内的代谢紊乱。通过进一步的层次聚类分析发现，茯苓中剂量、低剂量组的代谢物簇与对照组接近，说明低中剂量茯苓可以改善氯化钡诱导的斑马鱼的代谢谱。随后，作者通过网络药理学筛选的差异代谢物和靶点的联合富集分析，结果显示钙信号通路、肾素分泌、cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路是茯苓干预心律失常的主要途径（图5H）。 5.斑马鱼潜在靶点mRNA的表达和目标代谢的定量分析作者为了验证茯苓是否调控钙信号通路ADRB1、HTR7、CALMIB和PPP3CA的表达，利用RT-qPC进行验证。结果显示ADRB1、HTR7、CALMIB和PPP3CA的mRNA表达水平分别显著下降了6.37倍、3.27倍、15.06倍和3.75倍，表明氯化钡可通过下调斑马鱼体内ADRB1、HTR7、CALMIB和PPP3CA的mRNA表达水平引起心律失常。低、中、高剂量茯苓干预后，ADRB1 mRNA表达水平较低剂量模型组显著升高了3.08倍（图6A）。低、中、高剂量组大鼠HTR7表达量分别较模型组显著升高2.72倍、3.13倍、2.94倍（图6B）。低、中、高剂量组大鼠、CALM1B表达量分别较模型组显著升高4.45倍、3.93倍、2.31倍（图6C）。低、中剂量组中PPP3CA表达量上调2.94倍（图6D）。这些结果说明低、中剂量茯苓多糖对小鼠具有良好的抗氧化作用。为进一步分析茯苓对钙信号通路代谢产物以及以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的调控作用，作者测定了斑马鱼代谢产物中cAMP、缬氨酸和异亮氨酸的含量。结果显示与对照组相比，模型组中cAMP、缬氨酸和异亮氨酸的含量显著增加，分别增加了2.84倍、1.52倍和1.36倍。经不同剂量的茯苓治疗后，cAMP水平分别比模型组明显降低了1.57、1.63和1.79倍（图7A）。缬氨酸的含量分别比模型组明显减少了1.36倍、1.22倍和1.27倍（图7B）。异亮氨酸的含量也明显减少了1.42倍、1.27倍和1.20倍（图7C）。这些代谢物含量的变化表明，茯苓可以通过下调cAMP、缬氨酸和异亮氨酸的含量来发挥抗心律失常的作用。最后，作者进行了分子对接分析鉴定出的8种化合物与4种蛋白质（ADRB1、HTR7、CALMIB和PPP3CA），进一步对茯苓的潜在机制进行探究。结果表明这些化合物与这四种蛋白质的结合能很强。所有八种化合物与HTR7的结合能最低，表明HTR7是优先靶标。通过比较了非三萜类化合物7-OA与三萜类化合物的结合能力（图8）。7-OA与ADRB1、CALMIB和HTR7的结合能远远高于三萜类化合物。通过观察每种化合物与氨基酸残基的化学键，作者发现相应的化合物可以通过传统的氢键、范德华键和化学键与八种蛋白质相互作用。通过酶抑制实验验证了分子对接的结果。PA、DTA、PAA、7-OA、TA、OA、DBNA对ADRB1、HTR7、CALM1、PPP3CA等酶的抑制作实验发现不同的化合物对这四种蛋白质都有抑制作用。PA、DTA、PAA、7-OA、OA对ADRB1和HTR7的抑制率均大于50%，其中TA的抑制效果最强。与ADRB1和HTR7的抑制率相比，茯苓化合物对CALM1和PPP3CA的抑制率较弱，只有DTA对CALM1和PA对PPP3CA的抑制率高于50%（图7，表2，图9）。 表2茯苓中PPP3CA、ADRB1、CALM1、HTR7和8种化合物活性位点之间的分子相互作用的结合能和预测抑制常数 综上，这篇文章采用网络药理学+代谢组学，着重关注了茯苓药物对动物的代谢通路调控，采用PCR、分子对接、酶抑制和靶向代谢等方法，通过调节ADRB1、HTR7、CALM1B和PPP3CA的mRNA表达水平、钙离子信号通路中cAMP的代谢水平以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成中缬氨酸和异亮氨酸的代谢，验证了茯苓能够改善心律失常。整体来说，文章思路清晰完整，主题内容是通过网药分析、代谢组学等高通量方法实验，很值得各位小伙伴借鉴哦！小伙伴们如果感兴趣，更换个药物或者疾病，就可以复现，如果生信技术受限，或者缺乏研究设计新思路，欢迎扫码联系大海哥哦。医学海公众号持续为大家带来最新科研思路，想复现这种思路或者定制更多创新性思路欢迎直接call大海哥，竭诚为您的科研助理！
