拉曼显微镜能够在无需预处理的情况下测量样本的内部结构和化学成分等，但其在生物样品中的应用受到一定限制。大阪大学研究生院工学研究科的博士生水岛健太（现工作于约翰霍普金斯大学）、藤田克昌教授、山中真仁特任副教授、大阪大学先导性跨学科研究机构的熊本康昭副教授等人组成的研究团队，与大阪大学免疫学前沿研究中心的 Nicholas Smith 副教授、京都府立医科大学的田中秀央特任教授、理研环境资源科学研究中心的袖冈干子团队总监等人合作，成功开发出了一种能够冷冻生物样本并以高灵敏度观察分子的拉曼显微镜。藤田教授表示：“我们相信，这项技术能够在从基础研究到细胞产业实际应用的广泛领域中发挥作用。我们计划于明年创办公司，推动商业化进程。”相关研究成果已发表在期刊《Science Advances》上。
拉曼光谱法通过照射激光后测量从样本发出的拉曼散射光，能够在无需预处理的情况下非破坏性观察固体、液体、气体等物质的内部结构和化学成分等。该方法已经广泛应用于材料系统等领域，但由于细胞等生物样品的拉曼散射光微弱，提高激光功率则会损伤样本，而且在长时间测量过程中，样本的化学成分会因固定而发生变化，因此技术的应用范围较为有限。
研究团队开发出一种通过急速冷冻并在液氮温度下固定细胞等生物样本，从而实现长时间的拉曼观察的新方法。具体做法是，研究团队开发了一种独特的样本室，使用-185℃的液体丙烷对样本进行急速冷冻，此后通过周围安装的液氮流道进行持续冷却或使用加热器进行加热，从而在调节温度的同时固定样本。研究团队将100毫瓦的激光分为数百个激光点（每个点的功率为毫瓦级）同时照射样本，从而实现了对大范围区域的长时间观察。通过该方法，研究团队成功实现了高信噪比、高分辨率，以及在既往方法中无法达到的数百倍宽视野拉曼观察。水岛表示：“在开发冷冻方法时，我们遇到了许多困难。寻找合适的冷冻电镜制冷剂时，由于冷却剂本身也会产生拉曼散射光，我们进行了多次实验，始终无法正常成像，最终我们找到了使用液体丙烷的方法，这个过程最为艰难。”
在实验中，研究团队使用本次研究开发的显微镜对急速冷冻固定的细胞进行了长时间的拉曼观察，证实了该方法可以获得比既往方法高约8倍的拉曼信号。此外，研究人员还通过急速冷冻固定缺血大鼠心脏组织中的细胞色素c的氧化还原状态并进行拉曼观察，首次获得了在未固定的活体样本中无法观察到的缺血状态与正常状态心脏组织中细胞色素c氧化还原状态差异的显微镜图像。同时，这还成功将细胞观察中可识别的分子种类增至9种，增加到了既往方法的2倍左右。
藤田教授表示：“我们此前就有过冷冻样本的设想，但实验难度很大。最初，我们尝试将冷冻样本直接拿到显微镜下进行观察，但样本的状态会发生变化。于是，在2018年，我们提出了将冷冻过程直接集成到显微镜中的想法，次年我们的计划获得了CREST项目的资助，因而得以实现。此次实验的观察时间为10至20小时，若能进一步延长观察时间，将能够扩大观察范围并识别更多的分子种类。”
在药物研发、生殖医学、细胞治疗、再生医学、畜牧业和基础研究等广泛领域中，各种生物样本都需要被冷冻保存，而此次开发的方法同样适用于生物样本的质量控制和评估。事实上，大阪大学与岩谷产业公司的合作研究已表明，样本在运输过程中因温度波动会导致细胞存活率下降。此外，这项新方法为高灵敏度地拉曼观察生物样本中低浓度存在的药物等成分提供了可能，同时也使得观察冷冻瞬间生物样本中的分子化学状态成为可能。该技术有望在广泛的研究领域中发挥作用。
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Science Advances
论文：Raman microscopy of cryofixed biological specimens for high-resolution and high-sensitivity chemical imaging
DOI：doi.org/10.1126/sciadv.adn0110
