博客优策 | 你的RCL怎么做?一文速览实战经验,助你横扫合规内耗

文摘   科学   2024-10-10 18:00   上海  

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在往期文章中,我们深入探讨了慢病毒的独特属性以及它在检测上所面临的挑战。现在,让我们更进一步,探索在实际应用中如何合规且准确地进行可复制型慢病毒 (RCL) 的检测。
RCL检测之所以必要是因为曾在患淋巴瘤的实验恒河猴中发现高剂量的可复制型逆转录病毒 (RCR),因此人们认为具有复制能力的重组病毒是存在的,并有致瘤性风险。为了确保生物制品的安全性,对于RCL的检测是必不可少的。
由三质粒或四质粒系统瞬时转染得到的慢病毒载体,在理论层面上,拆分的关键元件有概率会重组在一起,导致产生具有复制能力的慢病毒RCL,由此提出了对于RCL的检测要求。那么RCL存在于我们生产过程中哪些阶段呢?我们可以通过何种方式对其进行检测呢?如图所示,涉及载体生产细胞如HEK293,病毒上清UPB,以及转导靶细胞如CAR-T。通过检测关键基因如GAG/POL/VSVG,以及编码得到的蛋白质如衣壳蛋白或酶如逆转录酶等可以检测具有复制能力的重组慢病毒的存在。
在RCL实际检测过程中,仍存在需突破的难点,例如缺乏标准的对照体系,以及缺乏合理的终点检测方法以确保结果的一致性和准确性,基于此类痛点问题,博瑞策生物制定了深入的研究方案并开展了全面的验证体系。

基于缺乏标准的对照体系,博瑞策生物提供的RCL检测服务包含生产终末细胞EOPC、转导细胞以及病毒上清,其中病毒上清由于含慢病毒载体,需先基于预实验排除对易感细胞的毒性作用以及抑制阳参HIV检出的可能性。正式实验会设置完善的对照体系,包括样品组、加标对照组、阳参、阴参,与易感细胞C8166共培养5代后收集上清液,进行终点检测。

RCL的终点检测法包括基于qPCR检测关键基因、ELISA检测P24、QPERT检测逆转录酶活,但由于质粒残留和Hook效应导致的假阳性情况,在诸多的方法中我们推荐使用逆转录酶活性测定分析方法 (PERT),相较于其他方法它的检测灵敏度更高,且可作为逆转录病毒的通用型检测。然而正是因为它的高灵敏度,对于实验环境要求很高。

逆转录酶是逆转录病毒生活周期中最重要的关键元件,我们的检测方法参考药典,将噬菌体的MS2 RNA作为模板,反应体系中不添加逆转录酶。供试品通过裂解释放其可能的酶,进行qPCR检测,若存在特异性的扩增曲线,说明存在逆转录酶活性,即含有可复制的逆转录病毒RCL。

博瑞策生物位于上海的GMP检测中心为QPERT实验设置了独立区域,并将阴性区、阳性区、准备区进行分隔,避免气溶胶污染导致的假阳性情况。如有需要,我们也可以提供多种终点检测方法组合,用于对结果的判读。
博瑞策生物基于上述思路,设计并验证了符合中美欧药典的RCL检测方案,并通过GMP体系管理,为慢病毒生产提供有效的风险控制。欢迎观看博瑞策生物“可复制型慢病毒检测”技术分享vlog,如有相关需求请联系博瑞策生物商务团队。

在后续内容中,我们将为您带来腺相关病毒生物安全、逆转录病毒生物安全的技术干货。持续精彩,尽在博客优策


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