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新兴药物形态广泛采用以细胞、病毒载体为药物递送方式实现对疾病的治疗和控制。传统意义上的细胞治疗 (血细胞, 免疫细胞, 干细胞等) 经基因工程的重组构建获得修饰细胞治疗产品 (CAR-T, TCR-T等) 在血液肿瘤治疗领域取得突破进展，并在实体肿瘤治疗应用中崭露头角。此外，通过病毒载体直接递送的方式进而实现基因修复、替代、编辑的治疗手段也在罕见病领域获得关注 (图1)。值得注意，在现有的新兴药物中，普遍采用了基因工程技术进行重组构建。重组病毒载体除了直接用于肿瘤细胞杀伤治疗外，也常作为基因递送载体用于新兴药物的生产 (图2)。![]()
图1 新兴药物的分类
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图2 病毒载体及病毒载体递送构建的免疫治疗方式
以重组慢病毒载体为例，利用人免疫缺陷病毒 (HIV) 的生命周期和核心结构元件分拆到不同质粒形成病毒构建系统。重组慢病毒构建体系已经完全剔除了野生病毒中与毒力相关的元件 (VIF, VPU等)，确保了重组病毒的安全性。同时，病毒核心结构的组成元件，结构蛋白 (Gag)，酶蛋白 (Pol) 和糖蛋白被分别构建到不同的质粒载体，实现复制缺陷型重组病毒载体的生产 (图3)。
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图3 慢病毒包装质粒构成
理论上，经过基因重组生产的病毒载体是不具有复制能力的，仅在感染靶细胞后实现目标基因的递送。由于可能发生的基因重组风险，曾在1992年使用莫罗尼小鼠鼠白血病病毒进行的基因治疗动物实验中，观察到实验动物由复制回复病毒造成的淋巴瘤致死事件 (J. Exp. Med. 1992,176: 1125-1135)。这引起监管部门对于使用重组病毒载体进行新兴药物开发中病毒复制型回复事件的关注 (FDA 2020 Gene Therapy CMC for IND)。截至目前，在慢病毒载体的应用案例中，还没有发现可复制型慢病毒存在的证据。然而，理论推导看来，慢病毒可复制型重组突变的可能性仍是存在的 (图4)。监管也明确要求对于可能出现可复制型慢病毒的生产阶段，载体终末生产细胞、病毒载体原液、转导后细胞进行检测分析。特别在近年来“黑框事件”中，还需要考虑到在患者体内的随机整合，造成的二次致瘤事件。![]()
图4 可复制型慢病毒假设
重组慢病毒在实际应用中也在使用不同的糖蛋白实现不同嗜性特征，达成对不同类型细胞实现有效的转导 (表1)。这些创新载体的应用可能存在不同的重组或生物安全重组事件的可能性。建立和验证有效的检测手段，对于新型病毒载体复制能力的分析成为目前监管和技术的挑战。因此，慢病毒载体的复制能力的检测更多的需要在充分理解应用场景下，完善对于病毒结构特征的分析研究，从而建立切实有效的检测模型。表1 不同糖蛋白结构病毒载体的应用
(Viruses 2020, 12, 1016. https://doi.org/10.3390/v12091016)
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重组病毒载体的应用除用于体外细胞改造之外，也在体内基因治疗应用中得到体现，包括但不限于重组腺相关病毒、重组腺病毒、重组单纯疱疹病毒等。这些病毒载体的天然重组事件发生频率较高，也切实观察到真实的重组复制型回复载体。这些病毒的野生型在自然人群中也是存在。因此，作为重要的产品杂质，这类复制型病毒往往需要进行定量控制 (图5)。![]()
(Methods Mol Biol. 2011:737:247-78. doi: 10.1007/978-1-61779-095-9-11.)
总之，重组病毒载体在当前的新兴药物应用中得到了广泛的关注和发展。对于重组产品潜在复制型病毒的安全评价一直是生物安全检测的重点。博瑞策生物将在后续内容中结合合规检测技术开发经验与同行探讨复制型病毒的检测技术手段。![]()
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